一次大強度耐力運動對大鼠骨骼肌蛋白質降解和AMPK活性變化的影響

馬延超，朱榮，許壽生，王瑞元

（1.洛陽師范學院 體育學院，河南 洛陽 471022；2.溫州醫學院，浙江 溫州 325035；3.北京體育大學，北京 100084）

一次大強度耐力運動對大鼠骨骼肌蛋白質降解和AMPK活性變化的影響

馬延超1，朱榮2，許壽生3，王瑞元3

（1.洛陽師范學院 體育學院，河南 洛陽 471022；2.溫州醫學院，浙江 溫州 325035；3.北京體育大學，北京 100084）

為探討一次大強度耐力運動過程中，AMPK活性變化對骨骼肌蛋白質降解的作用。將36只 SD大鼠進行一次跑臺運動，坡度5%，運動強度25 m/min，運動時間60 min。取樣為運動前、運動0.5、1 h，運動后1、2、6 h等6個點。使用高效液相色譜法測定AMP、ATP質量摩爾濃度；采用同位素技術測定腓腸肌中AMPK活性的變化；采用熒光定量PCR技術，測定腓腸肌中MuRF1、MAFbx基因表達量的變化。結果發現：(1)運動0.5 h到運動后即刻，AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP質量摩爾濃度比值升高(P<0.05)，運動后1、2、6 h組，腓腸肌AMP質量摩爾濃度及AMP、ATP質量摩爾濃度比值與安靜組比較差異沒有顯著性；ATP質量摩爾濃度各組變化不大，差異沒有顯著性。(2)AMPK活性在運動0.5 h后開始升高，運動后2 h達到最高，運動后6 h開始下降但還高于對照組。(3)與安靜組比較，運動0.5 h組、運動1 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量差異沒有顯著性；運動后1 h、2 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組比較升高，差異有非常顯著性(P<0.01)，分別升高1.98、3.57和1.95、2.55倍；運動后6 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組比較升高，差異有顯著性(P<0.05)。結果說明：一次性大強度耐力運動后1～6 h，骨骼肌蛋白質降解可能增強，其原因可能是AMPK活化，促進MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA基因表達，促進骨骼肌蛋白質的降解。

運動生物化學；腺苷酸活化蛋白激酶；泛素蛋白連接酶；蛋白質降解；大鼠；腺苷一磷酸

泛素蛋白酶體系統是一個主要的蛋白質降解系統，對動物的研究逐漸顯示：在肌肉萎縮過程中，泛素蛋白酶體系統促使蛋白質降解。Muscle Ring Finger 1(MuRF1)和 Atrophy F-box(MAFbx 也稱為 Atrogin-1)均屬于泛素蛋白連接酶，是目前發現的與骨骼肌蛋白質分解代謝關系最為密切的泛素蛋白連接酶。有報道在制動、去神經、后肢懸吊、饑餓以及病理情況(糖尿病、腫瘤、膿毒癥)下，骨骼肌萎縮的模型中，MuRF1、MAFbx表達量均明顯增高[1-3]。目前研究認為 MuRF1和MAFbx是骨骼肌蛋白質降解的標志。測定其表達量的變化可反映骨骼肌蛋白質的降解情況。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在真核細胞生物中廣泛存在，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。骨骼肌中 AMP含量升高是促進AMPK激活的主要因素。有報道機體在缺氧、缺血以及葡萄糖缺乏等情況下可激活哺乳動物細胞中的AMPK，其原因也是由于提高了 AMP含量、AMP與ATP的比值，促進了AMPK的激活。關于運動對AMP含量的影響，有資料顯示隨著運動強度的增加，AMP與ATP比值呈波動性上升趨勢[4]。

2005年，Thomson[5]研究報道AMPK可能抑制骨骼肌蛋白質的合成，其采用老年大鼠和成年大鼠為實驗對象，進行機械刺激促使大鼠肌肉肥大，觀察到隨著年齡增大，大鼠快肌肥大情況隨之下降，快肌中AMPK活性反而增加；大鼠慢肌纖維隨著年齡增大，肥大情況沒有差異，慢肌中AMPK的活性也沒有差異。研究者認為年齡造成AMPK活性的升高可能是造成快肌肥大程度減弱的原因。該研究觀察到隨著年齡增大大鼠快肌肥大情況隨之下降，推測AMPK可能有抑制蛋白質的合成，或者有促進蛋白質降解的作用。

有報道在運動過程中，AMPK活性顯著升高，能抑制蛋白質的合成[6]。而關于AMPK活性升高促進骨骼肌蛋白質降解的研究較少，2007年有報道用 5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5 -aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside，AICAR)處理C2C12肌管，觀察到基質中3-甲基組氨酸(3-methylhistidine，3-MH)含量升高和MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA的表達。3-MH是一種微量氨基酸，主要存在于骨骼肌的肌動蛋白和肌凝蛋白內(約91.1%)，是收縮蛋白質分解代謝釋放的產物，測定3-MH的釋放量可間接反映肌纖維蛋白的降解。因此，研究者認為AMPK活化刺激了C2C12肌管中肌纖維蛋白的降解[7]。目前，還沒有見到對一次大強度運動過程中，AMPK活性的升高對骨骼肌蛋白質降解的研究。本研究擬采用大鼠進行一次性大強度耐力運動模型，探討AMPK活性的變化，以及測定大鼠腓腸肌中MuRF1、MAFbx基因表達量的變化，探討在一次大強度耐力運動過程中，AMPK對骨骼肌蛋白質降解的作用。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF級)，8周齡，體重190～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物實驗經北京體育大學動物福利倫理審查委員會同意，并嚴格按照北京體育大學動物實驗室規定執行。屏障環境飼養，溫度(23±2)℃，相對濕度(65±5)%，晝夜明暗交替時間為12 h。每籠4只，自由飲食與飲水。

1.2 動物分組

36只大鼠分為6組，每組6只。安靜飼養3 d，以適應新環境。跑臺運動適應3 d(第1天10 min，10 m/min；第2天15 min，10 m/min，第3天15 min，15m/min)，休息1 d，然后進行一次性大強度耐力運動(25 m/min，5%坡度)，除安靜組不運動，運動0.5 h組運動時間為0.5 h外，其它組運動時間為1 h。根據動物運動時間和取材時間分組為：安靜(C)、運動0.5 h(T1)、運動1 h(T2)、運動后1 h(T3)、運動后2 h(T4)、運動后6 h(T5)。

1.3 樣品制備

根據分組情況進行取材，大鼠稱重后，用質量分數為2%戊巴比妥鈉(注射劑量為100 g體重0.25 mL)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后，迅速取等量的紅、白腓腸肌，放入液氮中速凍保存。取材完成后把標本轉移至-80 ℃冰箱保存，待用。

2 方法

2.1 骨骼肌AMP、ATP質量摩爾濃度的測定

使用高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)測定 AMP、ATP 質量摩爾濃度。

樣品前處理：用電子天平稱取肌組織50 mg，用眼科剪剪碎后，加入0.5 mL質量分數0.9%NaCl溶液(內含0.5 mmol/L EDTA-2Na)和0.5 mL體積分數3% HClO4溶液，用電動勻漿器冰浴勻漿。勻漿后，4 ℃下沉淀蛋白(靜置時間不少于10 min)，3 000 r/min，4 ℃，離心10 min。取上清液0.5 mL，加入質量分數20% KOH溶液 40 μL，4℃靜置 30 min，11 000 r/min，5 min離心，取上清200 μL，-80 ℃保存待測。

分析條件：高效液相色譜儀(Agilent 1100 series，德國Agilent公司)，5 μm，150 A反相柱(4.6 mm×150 mm) cat.NO：Vs951505-0。流動相為磷酸鉀緩沖液(50 mmo1/L KH2PO4)、甲醇和離子對試劑A的混合液(磷酸鉀緩沖液和甲醇的體積比為76︰24，混合液中離子對試劑A的濃度為5 mmol/L，最后調pH至5.8)，等比洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長259 nm。柱溫20 ℃，進樣量 20 μL。根據標準品濃度和其相應的積分面積繪制出標準曲線，再根據標準曲線，計算出各個樣品的質量摩爾濃度。

2.2 AMPK活性的測定方法

方法與參考文獻[8]同。

2.3 用實時熒光定量PCR技術測定腓腸肌 MAFbx和MuRF1基因表達

方法與參考文獻[8]同。

2.4 統計學處理

數據以均數±標準差表示，采用 SPSS統計軟件包進行單因素方差分析。以P<0.05表示差異有顯著性水平，以P<0.01表示差異有非常顯著性。

3 結果與分析

3.1 一次大強度耐力運動各組 AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP質量摩爾濃度比值的變化

與安靜組比較，運動0.5 h組和運動1 h組大鼠腓腸肌AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP質量摩爾濃度比值升高，差異有顯著性(P<0.05)，運動后1、2、6 h組，腓腸肌AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP質量摩爾濃度比值與安靜組比較差異沒有顯著性；ATP質量摩爾濃度各組差異沒有顯著性。AMP、ATP質量摩爾濃度測定結果見表1。

表1 各組動物實驗前后AMP、ATP質量摩爾濃度及AMP與ATP質量摩爾濃度比值（±s）的變化

表1 各組動物實驗前后AMP、ATP質量摩爾濃度及AMP與ATP質量摩爾濃度比值（±s）的變化

1)與安靜組比較，P<0.05

組別 b(AMP)/(nmol·mg-1) b(ATP)/(nmol·mg-1) b(AMP)/b(ATP)C 53.64±5.91 252.76±11.79 0.21±0.05 T1 77.05±9.571) 239.56±11.63 0.32±0.091)T2 71.27±2.231) 245.89±38.80 0.29±0.031)T3 61.01±14.30 261.09±25.18 0.23±0.03 T4 54.14±4.57 308.09±29.40 0.18±0.05 T5 52.48±11.38 301.33±47.80 0.17±0.07

3.2 一次大強度耐力運動各組AMPK活性的變化

與安靜組AMPK活性(1.86±0.27) nmol·g-1·min-1比較，運動各組AMPK活性升高，差異有顯著性或非常顯著性(P<0.05或P<0.01)，且運動后1 h組達到最高，運動后6 h組AMPK活性開始下降。運動0.5 h、運動1 h、運動后1 h、運動后2 h、運動后5 h的AMPK活性分別為(3.65±0.22)、(5.19±0.87)、(5.90±0.62)、(5.84±0.60)、(5.24±0.80) nmol·g-1·min-1，運動 0.5 h、運動1 h、運動后5 h差異有顯著性，運動后1、2 h差異有非常顯著性。

3.3 一次大強度耐力運動各組 MuRF1mRNA和 MAFbx mRNA表達量的變化

與安靜組相比，運動0.5 h、1 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量差異沒有顯著性；運動后2 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組比較，差異有非常顯著性(P<0.01)，分別升高 1.89、3.57和1.95、2.55倍；運動后6 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組相比較，差異有顯著性(P<0.05)(見圖 1、2、3)。

圖1 MAFbx實時熒光定量PCR熔解、擴增曲線

圖2 MuRF1實時熒光定量PCR熔解、擴增曲線

圖3 GAPDH實時熒光定量PCR熔解、擴增曲線

4 討論

4.1 一次大強度耐力運動各組 AMP質量摩爾濃度、AMP與ATP比值和AMPK活性的變化

骨骼肌收縮和運動時，ATP被大量消耗，相應地，AMP大量產生，AMP與ATP比值升高導致AMPK的激活。有資料顯示隨著運動強度的增加，AMP與ATP比值呈波動性上升趨勢[4]。本研究采用一次性大強度耐力運動，觀察到運動0.5 h組和運動1 h組大鼠腓腸肌AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值與安靜組相比升高，差異有顯著性(P<0.05)，運動后1、2、6 h組，腓腸肌AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值與安靜組比較差異沒有顯著性；ATP質量摩爾濃度與安靜組比較，差異沒有顯著性(見表1)。本研究觀察到運動后各組與安靜組比較，AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值差異沒有顯著，說明運動后AMP消除較快。張國華[6]報道大強度運動后即刻 AMP含量，AMP與 ATP比值與安靜組比較顯著性升高，運動后1、6 h組，AMP、AMP與ATP比值與安靜組比較差異沒有顯著性，與本研究結果相一致，支持本研究結果。

與安靜組相比，運動各組AMPK活性升高，差異有顯著性或非常顯著性(P<0.05或P<0.01)，且運動后1 h組達到最高，運動后6 h組AMPK活性開始下降。結合本次測定的AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值在運動中顯著升高，本研究認為AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值升高可能對促進AMPK激活具有重要作用。同時觀察到AMPK的活性具有延遲性，當運動后AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值降低時，AMPK活性仍然處于較高水平，與AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值變化不一致。本研究觀察到運動后6 h，AMPK活性仍然高于安靜組，該研究結果與張國華[6]的結果不同，其研究觀察到運動后即刻 AMPK活性顯著升高，運動后1 h恢復到安靜水平。研究結果的不同可能與研究對象、運動強度不同有關，張的研究對象是腓腸肌的白肌，而本研究的對象是腓腸肌的紅白肌各半。有報道運動能顯著的升高慢肌比目魚肌AMPK的磷酸化，而不能使快肌中AMPK的磷酸化升高[9-10]。AMPK磷酸化是反映AMPK活性的一個指標，AMPK磷酸化增加，其活性增強。本研究取樣用腓腸肌紅白肌各半，樣品中紅腓腸肌含量升高，可能是AMPK活化持續時間延長的原因。其研究觀察到AMPK活性在運動后即刻最高，在運動后1 h恢復到安靜水平，也說明AMPK活性恢復較慢，與本研究觀察到AMPK活性具有延遲性具有一致性。

4.2 一次大強度耐力運動各組 MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA表達量及AMPK活性的變化

MuRF1和MAFbx均屬于泛素蛋白連接酶，是目前發現的與骨骼肌蛋白質分解代謝關系最為密切的泛素蛋白連接酶。在制動、去神經、后肢懸吊、饑餓等多種骨骼肌萎縮模型中，這兩種酶的表達均明顯增高[11-12]。有研究認為MuRF1和MAFbx可作為骨骼肌萎縮的早期標志物，幫助診斷肌肉萎縮方面的疾病。

運動對MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達的影響報道不一。有報道抗阻運動后即刻到運動后24 h內，MuRF1 mRNA表達量升高[13-16]；在抗阻運動后即刻或運動后4 h內MAFbx mRNA表達量升高[13，17]，另有報道在進行抗阻運動后幾小時內，這些基因或者降低，或者不變[18-19]。但多數研究結果都認為MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量在運動后增加，在數小時內最高，到運動后24 h恢復到安靜狀態。而關于一次性耐力運動對MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA基因表達的報道較少，有報道人進行跑步運動后1～4 h內MuRF1 mRNA增加3.6倍，MAFbx mRNA增加1.6倍；而進行抗阻運動后1～4 h內，MuRF1 mRNA增加3.5倍，MAFbx mRNA表達不變化，認為跑步比抗阻運動更能誘導蛋白質分解相關基因的表達[13]。

本研究采用大鼠一次性大強度耐力運動模型，觀察到運動0.5、1 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組相比差異沒有顯著性；運動后1、2 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組相比升高，差異有非常顯著性(P<0.01)，分別升高1.89、3.57和1.95、2.55倍；運動后6 h組MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量與安靜組相比升高，差異有顯著性。這與多數報道抗阻運動后MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量升高的結果相一致，同時與Louis E[13]研究跑步運動后MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表達量升高的結果相一致。

關于探討 AMPK活性與骨骼肌蛋白質代謝的關系。2005年Thomson[5]研究報道AMPK可能抑制骨骼肌蛋白質的合成，其采用老年大鼠和成年大鼠為實驗對象，進行機械刺激促使大鼠肌肉肥大，觀察到隨著年齡增大大鼠快肌肥大情況隨之下降，快肌中 AMPK活性反而增加；大鼠慢肌纖維隨著年齡增大肥大情況沒有差異，慢肌中 AMPK的活性也沒有差異。研究者認為隨著年齡增大，AMPK活性升高可能是造成快肌肥大程度減弱的原因。2007年有報道用AMPK激活劑AICAR處理C2C12肌管，觀察到基質中3-MH的含量和MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA的表達量升高，認為AMPK活化刺激了 C2C12肌管中肌纖維蛋白質的降解[7]。2010年馬延超[8]報道用AICAR注射大鼠后肢大腿提高骨骼肌中 AMPK的活性，觀察到大鼠骨骼肌中 MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達量升高，認為AMPK活性升高能促進骨骼肌蛋白質的降解。

本研究探討一次大強度耐力運動過程中，AMPK活性變化與MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達量的關系，觀察到在運動后1、2、6 h組，AMPK的活性和MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達量的變化成一致性，隨著AMPK活性升高，MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達量升高。這與Nakashima[7]的研究結論相一致。而在運動過程中，即運動0.5、1 h組，AMPK活性升高，MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA的表達量卻沒有變化，這與我們的假設一次大強度耐力運動過程中，AMPK活性升高促進 MuRF1 mRNA和 MAFbx mRNA表達量升高的結論不一致。推測其原因可能有兩方面：(1)可能是由于運動0.5～1 h過程中AMPK活性是逐漸升高，促進MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達的作用可能不是很強，或者是由于AMPK作用具有一定的潛伏期，所以，在運動過程中，沒有觀察到MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達量相應升高；(2)在運動中，機體為了持續的運動，可能通過其它途徑，抵消了AMPK活性升高，促進MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA表達的作用，抑制骨骼肌蛋白質的降解，而在運動后，機體的保護效應解除，AMPK活性升高促進MuRF1 mRNA和MAFbx mRNA的表達，促進了骨骼肌蛋白質的降解與重構。

總之，本研究認為大鼠進行一次性大強度耐力運動，AMP質量摩爾濃度及AMP與ATP比值在運動中顯著升高，在運動后迅速恢復。AMPK活性在運動0.5 h后開始升高，持續到運動后6 h。在大強度耐力運動后，AMPK活性升高可能對促進了 MAFbx mRNA和MuRF1 mRNA的表達，促進了骨骼肌蛋白質的降解具有一定的作用。

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Effects of one time high intensity endurance exercising on the degradation of skeletal muscle protein and changes of AMPK activity in rats

MA Yan-chao1，ZHU Rong2，XU Shou-sheng3，WANG Rui-yuan3
(1.School of Physical Education，Luoyang normal University，Luoyang 471022，China；2.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China；3.Beijing Sport University，Beijing 100084，China)

The authors probed into functions played by changes of AMPK activity in the degradation of skeleton muscle protein during one time high intensity endurance exercising. Method: let 36 SD rats do a one time treadmill exercise at a slope of 5%, an exercise intensity of 25 m/min, and an exercise time of 60min. Sampling times were before exercising, after 0.5h and 1h of exercising, 1 h, 2 h and 6 h after exercising. The authors measured AMP and ATP molalities by using high efficiency liquid chromatography, changes of AMPK activity in gastrocnemius muscle by using isotope technology, and changes of MuRF1 and MAFbx gene expressions in gastrocnemius muscle by using fluorescence quantification PCR technology. Results: 1) from the moment after 0.5 h of exercising to the movement immediately after exercising, AMP molality and the ratio of AMP molality to ATP molality increased(P<0.05); there was no significant difference in AMP molality and the ratio of AMP molality to ATP molality in gastrocnemius muscle between 1 h, 2 h and 6h after exercising groups and the calm group; there was no significant change or difference in ATP molality between various groups; 2) AMPK activity started to increase after 1.5 h of exercising, reached its peak at 2 h after exercising, started to lower at 6 h after exercising but was still higher than that of rats in the control group; 3) there was no significant difference in MuRF1 mRNA and MAFbx mRNA expression volumes between after 0.5h and 1h of exercising groups and the calm group; compared with those of rats in the calm group, MuRF1 mRNA and MAFbx mRNA expression volumes of rats in 1h and 2 h after exercising groups increased by 1.98 times, 3.57 times and 1.95 times 2.55 times respectively, and the differences were very significant(P<0.01); compared with those of rats in the calm group, MuRF1 mRNA and MAFbxmRNA expression volumes of rats in the 6h after exercising group increased, and the differences were significant (P<0.05). The results indicate that in 1-6 h after one time high intensity endurance exercising, the degradation of skeletal muscle protein may be intensified, possibly by MAFbx mRNA and MuRF1 mRNA gene expressions promoted by AMPK activation.

exercise biochemistry；AMPK；MAFbx；MuRF1 mRNA；protein degradation；rat；AMP

G804.7

A

1006-7116(2011)02-0139-06

2010-10-13

國家自然科學基金項目(30971411)；河南省科技廳項目(102102310324)。

馬延超（1969-），男，副教授，博士，研究方向：骨骼肌蛋白質代謝。