zVAD-fmk 對未成熟樹突狀細胞誘導初始性CD4+ T 細胞分化為調節性 T 細胞影響的體外研究

駱志清 王毅 錢坤 羅志剛 郭軍華 屈小勇

Sakaguchi 等[1]于 1995 年在小鼠和體外實驗中發現，胸腺來源的CD4+CD25+T 細胞具有免疫無反應性和免疫抑制性兩大功能特征。輔助性 T 細胞的誘導和分化主要是幼稚性 T 細胞通過抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)與 T 細胞表面表達的 TCR 結合產生的。樹突狀細胞（dendritic cell, DC）是體內最強的抗原提呈細胞，它來源于造血干細胞，廣泛分布于淋巴組織和非淋巴組織，能夠顯著刺激初始狀 T 淋巴細胞增殖。DC 與其他抗原呈遞細胞相比其最大的特點是能顯著刺激初始型 T 細胞增殖，是唯一能活化初始型 T 細胞的抗原呈遞細胞。在 T 細胞分化過程中，活化的 T 細胞對 Fas 介導的凋亡信號敏感性增加，部分 APC 亞群可高表達 Fasl（Fas配體），可以致活化的 T 細胞凋亡并誘導特異性免疫耐受[2]。本研究前期已經建立了較為成熟的 DC 體外培養方法，我們通過阻斷 T 淋巴細胞凋亡信號通路，以未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells, imDC)誘導初始性CD4+T 細胞生成調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)，通過其表面分子的表達，計算初始性 CD4+T 細胞轉化為Treg 細胞的轉化率，研究 imDC和 Caspase 通路在 Treg 細胞生成中的作用，為臨床免疫耐受的研究提供理論依據。

材料和方法

一、材料

RPMI-1640、胎牛血清和淋巴細胞分離液、重組人 IL-4、IL-2、GM-CSF、TNF-α；人 CD4+T細胞陽性分選試劑盒和MPCS磁力架；鼠抗人CDla、CD80、CD83單克隆抗體以及鼠抗人CD4、CD25單克隆抗體；絲裂霉素、DMSO、zVAD-fmk；單克隆抗體-磁珠分離系統(Mini-MACS)。

二、方法

(一) imDC 的體外誘導

取健康成年人肘靜脈血約 50 ml 以梯度密度離心法分離人外周血中單個核細胞。通過 6 孔板培養的單核細胞為半貼壁細胞，以 rhIL-4、rhGM-CSF培養5 d，收集imDC，自第7天開始換用帶有rhTNF-α、rhGM-CSF的培養基，3 d半量換液，第14天收獲成熟的DC（mDC）。

（二）DC的鑒定

流式細胞術（ flowcytometry, FCM）檢測DC 表面分子。

（三）CD4+ T 細胞的提取

采集平產健康胎兒臍血10 ml，密度梯度離心法 （同上）分離單個核細胞，將上述分裝單個核細胞 （4℃）通過免疫磁珠法分選出CD4+T細胞。

（四）實驗分組

臍血初始性 CD4+T 細胞均分為5 組：空白組為CD4+T細胞 （1×106/ml）加入等容量的RPMI-1640單獨培養。外周靜脈血imDC（1×105/ml）與初始性CD4+T細胞 （1×106/ml）混合培養，按不加其他試劑、加入 10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L 濃度的 zVAD-fmk 分為 ：混合對照組、低濃度zVAD-fmk組、中濃度zVAD-fmk組、高濃度zVAD-fmk組。各組細胞于20 U/ml IL-2，37℃，5﹪CO2培養箱中培養5 d。

（五）T 細胞轉化率的測定

取混合培養 5 d 的 T細胞懸液（1×106/ml），加入FITC-CD4和FITC-CD25單克隆抗體，以流式細胞儀檢測CD4、CD25分子的表達率。

三、統計學處理

實驗數據應用 SPSS 13.0 統計軟件處理，表面分子表達結果和細胞轉化率檢測指標用x±s表示，組間的差異比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），判斷imDC低、中、高濃度組zVAD-fmk組、imDC不加zVAD-fmk和空白組是否存在差異，采用LSD法兩兩比較，以P< 0.05為差異有統計學意義。

實驗結果

一、流式細胞術檢測 DC 表面分子

培養至7d的imDC細胞懸液，加入熒光標記的單克隆抗體PE-CD1a、PE-CD80和PECD83，經FCM檢測其細胞表面分子的表達，與培養至14d的成熟DC表面分子CD80、CD83和CD1a比較，P均< 0.05，imDC表面表達的CD80，CD83和CD1a分子明顯低于DC的表達，其流式結果見表1及圖1～7。

二、CD4+T 細胞轉化為 Treg 細胞的轉化率的測定

從胎兒臍血提取的 CD4+T 細胞與 imDC 混合培養 5 d 后，加入FITC-CD4和PE-CD25單克隆抗體，以流式細胞儀檢測CD4和CD25分子的表達率。

各組間經過均數的兩兩比較，混合對照組與低濃度zVAD-fmk組之間，以及中濃度zVAD-fmk組與高濃度zVAD-fmk組之間T細胞轉化率差異無顯著性（P> 0.05），其他各組間轉化率差異有統計學意義（P< 0.05）（表2，圖8～13）。

表1 imDC 與成熟 DC 表面分子表達的流式細胞儀檢測結果（﹪，± s）

表1 imDC 與成熟 DC 表面分子表達的流式細胞儀檢測結果（﹪，± s）

注：aFCM檢測的表面分子每個檢測5組數據

DC 表面分子 樣品數 imDC DC CD80 5 7.27 ± 0.13a 52.49 ± 0.51 CD83 5 3.53 ± 0.35 82.77 ± 1.19 CD1a 5 4.29 ± 0.27 79.30 ± 0.69 F 值 276.090 1925.833 P 值 0.000 0.000

圖1 imDC 表面 CD80 表達率流式

圖2 DC 表面 CD80 表達率流式

圖4 DC 表面 CD83 表達率流式

圖3 imDC 表面 CD83 表達率流式

圖5 imDC 表面 CD1a 表達率流式

圖6 DC 表面 CD1a 表達率流式

圖7 imDC與成熟 DC 表面分子表達的流式細胞儀檢測結果

表2 T 細胞轉化率的檢測結果

圖8 空白組 T 細胞轉化率流式

圖9 混合對照組 T 細胞轉化率流式

圖10 低濃度組 T 細胞轉化率流式

圖11 中濃度組 T 細胞轉化率流式

圖12 高濃度組 T 細胞轉化率流式

圖13 T 細胞轉化率的檢測結果

討 論

imDC模型和Treg 細胞模型建立是當前移植免疫耐受的研究重點之一，目前已經成功建立起了由人外周血單核細胞分離誘導培養的imDC和由人外周血分離的CD4＋T細胞，并且也找到了從imDC誘導初始性T細胞轉化為CD4+CD25+T細胞的方法，而CD4+CD25+T細胞具有免疫耐受的功能，因此前述的研究工作對于進一步探討建立移植免疫耐受奠定了一定的基礎。但是imDC誘導CD4+T細胞轉化為Treg細胞的機制仍未十分明了，凋亡細胞傳導通路在Treg細胞的活化和成熟過程中所起到的作用也未明了。因此本研究通過建立imDC的細胞模型，與初始性CD4+T細胞混合培養，誘導初始性CD4+T細胞轉化為Treg細胞，并阻斷T細胞的Caspase信號傳導通路，以研究該信號通路在CD4+T轉化為CD4+CD25+T細胞過程中的作用，為免疫耐受在臨床中的應用提供理論依據。

一、imDC 誘導臍血初始性 CD4+T 細胞轉化為Treg細胞

本實驗的關鍵在于以 imDC 與臍血初始性CD4+T 細胞進行混合培養，從而誘導其轉化為Treg 細胞。已有研究證明，DC 多數由其表面的自身抗原與Treg 細胞表面表達的TCR相互作用，使一些具有高親和力的或者競爭結合自身抗原的胸腺細胞不被克隆清除而是繼續分化，參與 Treg 的陽性選擇[3-4]。DC 誘導產生效應性T細胞還是 Treg 細胞在很大程度上取決于其成熟狀態，即 DC/imDC 的比例[5]。如果能控制 DC 的成熟狀態，就有可能使T細胞在活化階段發生轉化。imDC 誘導 Treg 的機制在于其雖然可以攝取自身抗原，但是其呈遞抗原的能力不強，并且 imDC 上缺乏能使 CD4+T 細胞活化為效應性 T細胞的共刺激分子，如前所述的CD80和CD86 等分子，所以當T細胞接受 DC提呈的自身或外周抗原后不能活化為效應性 T細胞，從而產生對此抗原的耐受。但是 imDC 誘導 Treg 的分子機制還不是很清楚。

二、Caspase 信號通路的阻斷對誘導 Treg 細胞的影響

zVAD-fmk為caspase阻斷劑，能夠抑制細胞 AICD 發生過程中多種 Capase酶的活性。zVAD-fmk 是一種細胞可通透性泛 Caspase抑制物，不可逆地結合在 Caspase 蛋白酶的催化位點，可抑制細胞凋亡的誘導[6-7]。本研究在DC與初始性 CD4+T 細胞混合培養時以 zVAD-fmk為阻斷劑，阻斷初始性CD4+T 細胞凋亡信號傳導通路，研究 imDC 細胞誘導 Treg 細胞時是否通過 Caspase 通路起作用，從而促進初始性 CD4+T細胞轉化為CD4+CD25+T細胞。

本研究以低濃度的GM-CSF 和 IL-4 誘導出第 7 天的 DC（即imDC）與初始性CD4+T細胞混合培養，各組細胞分別培育5 d后再以 FCM檢測初始性 CD4+T細胞轉化為 Treg 的轉化率。經FITC-CD4抗體和PE-CD25抗體標記的各組 T 細胞，通過流式細胞儀檢測其轉化率，其結果除混合對照組和低濃度組、中濃度組和高濃度組之間外，各組間差異有統計學意義（P< 0.05）。結果說明：加入zVAD-fmk 并與 imDC 細胞混合培養的 T 細胞轉化率相對于未加入阻斷劑的T 細胞較低，同時 Caspase 信號通路對 zVAD-fmk 無濃度依賴性，而表現出“全”或“無”的效應。zVAD-fmk 低于閾濃度時，對信號通路無影響，超過閾濃度時，效果不隨濃度增高。通過本實驗可以提示：人外周血 imDC 可以誘導初始性 CD4+T 細胞轉化為CD4+CD25+T 細胞，從而誘導外周免疫耐受。

三、展望

建立移植免疫耐受是解決移植排斥反應的一個可行方法。但是目前對于誘導免疫耐受僅限于體外細胞研究，并且主要集中在 imDC 對免疫耐受的誘導和Treg 細胞在耐受中的作用。DC 作為體內最強的 APC，在其未成熟階段其表面缺乏共刺激分子，雖然有較強的抗原呈遞能力，卻不能有效地激活 T 細胞，從而產生耐受。目前，對 Treg 細胞的研究正步入一個新的階段，已從對其存在的證實轉到對其生物學意義的關注，對 Treg 細胞生物學作用的揭示，不但能更好的理解機體免疫耐受的機制，還有助于對感染免疫、腫瘤的發生機理和移植耐受誘導的認識。本實驗通過人外周血誘導生成 imDC，由 imDC 與初始性CD4+T細胞混合培養，研究imDC 誘導免疫耐受的機制，并通過阻斷 T 細胞 Fas/FasL通路，探討凋亡信號在 imDC 誘導產生 Treg 細胞中的作用。從信號通路水平對 DC 和 Treg 細胞的研究，本研究探討了外周免疫耐受的形成機制，對臨床器官移植病人的免疫耐受的誘導提供了理論依據。

1 Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunological self-tolerance maintained by activated T cells expression IL-2 receptora-chains (CD25):Breakdown of single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease[J]. Immunol, 1995, 155(3):1151-1164.

2 Suss G, Shortman K. A subclass of dendritic cells kills CD4 T cells via Fas/Fas-ligand-induced apoptosis[J]. Exp Med, 1996, 183(4):1789-1796.

3 Kawahata K, Misaki Y, Yamauchi M, et al. Generation of CD4+CD25+regu1atory T cells from autoreactive T cel1s simultaneously with their negative selection in the thymus and from nonautoreactive T cells by endogenous TCR expression[J]. Immunol, 2002, 168 (9): 4399-4405.

4 Pacholczyk R, Kraj P, lgnatowicz L. Peptide specificity of thymic selection of CD4+CD25+T cells[J]. Immunol,2002, 168 (2): 613-620.

5 Jonuleit H, Schmitt E, Steinbrink K,et al. Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells[J]. Trends in Immunology, 2001, 22 (7):394-400.

6 Eric A, Atkinson. Michele Barry Cytotoxic T Lymphocyte-assisted Suicide. Caspase-3 activation is primarily the result of the direct action of granzyme B[J]. Biol Chem, 1998, 273(33): 21261-21266.

7 Ella Bossy-Wetzel. Mitochondrial cytochrome c release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization[J]. EMBO,1998, 17(1):37-49.