玉米彎孢葉斑病菌ATMT轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化及轉(zhuǎn)GFP單孢的獲得

陳茂功，林小虎，李洪杰，王曉鳴* ，周印富*

(1河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066004;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)

由新月彎孢(Curvularia lunata(Wakker)Boed)引起的玉米彎孢葉斑病已成為一種重要的葉部病害，對(duì)我國(guó)玉米生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失，一般會(huì)促使玉米減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重為害時(shí)減產(chǎn)50%以上，甚至絕收［1～4］。目前對(duì)該病害研究主要集中在抗病品種與變異和致病機(jī)理等方面［5，6］，但對(duì)該病菌在玉米葉片上的侵染及發(fā)育過(guò)程仍不十分清楚。

GFP基因作為一種活體報(bào)告基因，其應(yīng)用已深入到植物病害研究中的各個(gè)方面，如對(duì)植物病原體的侵染、致病機(jī)理的研究［7，8］。本研究擬建立一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)彎孢菌的轉(zhuǎn)化方法，同時(shí)將GFP基因轉(zhuǎn)入到彎孢葉斑病菌中，獲得該菌轉(zhuǎn)化子，以便進(jìn)行侵入機(jī)理研究。

1 材料和方法

1．1 菌株

玉米彎孢葉斑病菌(C．lunata)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所檢疫基地保存;農(nóng)桿菌菌株為AGL-1，質(zhì)粒以pCAMBIAI300為骨架構(gòu)建了pCAMDGFP［9］，并含有潮霉素B(HyB)和卡那霉素(kan)抗性，由 Marina Franceschetti(john inner Center，UK)惠贈(zèng)。

1．2 主要試劑

潮霉素B、頭孢噻肟鈉、卡那霉素、乙酰丁香酮、MES購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他所用試劑均購(gòu)于北京萬(wàn)鑫化業(yè)商貿(mào)中心。

1．3 方法

1．3．1 頭孢噻肟鈉對(duì)農(nóng)桿菌抑菌濃度的測(cè)定 將農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖培至OD600約為0．6后，取100 μL分別涂于含有頭孢噻肟鈉 (0，50，100，150，200 mg/L)的 PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3次重復(fù)，25℃下培養(yǎng)4 d后觀察農(nóng)桿菌菌落的生長(zhǎng)情況，確定頭孢噻肟鈉的抑菌濃度。

1．3．2 潮霉素B對(duì)彎孢菌菌落生長(zhǎng)的抑制測(cè)定 在含不同質(zhì)量……