豬IL-18在桿狀病毒/昆蟲細胞中的表達

王振亞，王彥彬，陳紅英，邵攀峰，寧曉東，潘娜，韓利靜，崔保安

1 河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002

2 河南省動物性食品安全重點實驗室，鄭州 450002

豬IL-18在桿狀病毒/昆蟲細胞中的表達

王振亞1,2，王彥彬1,2，陳紅英1,2，邵攀峰1,2，寧曉東1，潘娜1，韓利靜1，崔保安1,2

1 河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002

2 河南省動物性食品安全重點實驗室，鄭州 450002

IL-18作為一種多效性細胞因子，在機體免疫應答及各種生理功能中發揮著重要的調節作用，根據豬IL-18基因序列設計1對引物，將編碼豬IL-18的成熟蛋白基因亞克隆到桿狀病毒轉移載體pFastBacDual中，并在C端融合6個組氨酸標簽以利于純化，然后轉化到含穿梭載體Bacmid的感受態細胞DH10Bac中，發生轉座作用。將重組質粒轉染昆蟲細胞，SDS-PAGE可檢測到分子量為18 kDa左右的重組蛋白，Western blotting證實該重組蛋白可與兔抗豬IL-18抗體發生特異性反應。純化后蛋白能明顯促進豬T淋巴細胞轉化，表明所表達的IL-18具有較高的生物活性。此研究為進一步開發研制新型免疫佐劑奠定了基礎。

豬白細胞介素-18，昆蟲細胞，表達

Abstract:IL-18, as a polyphonic cytokine, is important in immune response and physiologic function. We designed one pair of primers, amplified the porcine IL-18 gene fused with a C-terminal 6×Histidine tag, and then subcloned into the pFastBacDual of Baculovirus transfer vector and transformed into DH10Bac containing a shuttle vector of Bacmid. After co-transfecting the recombinant plasmid into insect cells, the 18 kDa expressed protein of porcine IL-18 was detected by SDS-PAGE; the specificity of expressed protein was confirmed by Western blotting. The purified porcine IL-18 protein induced obvious proliferation of porcine T lymphocytes in vitro, which indicated that the expression of IL-18 had high biological activity.

Keywords:porcine Interleukin-18, insect cells, expression

白細胞介素-18(Interleukin-18，IL-18) 是一種重要的細胞免疫調節因子，能誘導Th1等細胞產生大量 IFN-γ，故又稱為干擾素 γ誘生因子。研究表明IL-18可刺激Th1細胞高水平誘生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等細胞因子，促進T細胞的增殖，顯著增強Th1細胞和NK細胞的細胞毒作用等免疫調節功能。1995年日本學者 Okamura等[1]首次報道從中毒性休克的鼠肝臟中克隆出了該因子。1996年 Ushio等[2]從鼠cDNA庫中篩選到人IGIF基因，其序列與所有已知的細胞因子不同，并能在大腸桿菌中表達，且生物活性多樣，如抗病毒、抗結核分支桿菌、抗真菌[3]、抗腫瘤免疫[4]、抗變態反應性疾病作用[5]及前炎因子活性[6]，故將其正式命名為白細胞介素-18。1999年Muneta等[7-8]從豬肺泡巨嗜細胞中克隆到豬IL-18，并證明表達的豬 IL-18成熟蛋白比前體蛋白具有更高的活性。

IL-18作為一種多效性細胞因子[6]，在機體免疫應答和各種生理功能的調節作用及其臨床應用受到重視，迄今已成功克隆了人和多種動物的 IL-18基因，IL-18 mRNA在多種器官、組織、細胞中均可測到，如胸腺、肝臟、脾臟等。在抗腫瘤、抗感染及免疫調節、抗超敏反應、抗自身免疫性糖尿病、抗類風濕性關節炎等方面有著積極的作用[3-5]，具有潛在的應用前景。IL-18也具有抗多種病毒功能，尤其是對甲型流感病毒、單純皰疹病毒(HSV-1)、牛痘病毒及腦心肌炎病毒(EMCV)的復制和表達具有抑制作用。

本實驗室前期在 IL-18方面做了大量的工作。豬IL-18[9]、雞IL-18[10]、鴨IL-18[11]在原核細胞和真核細胞都已經作了大量的基礎研究。為了研究豬IL-18在昆蟲細胞中真核表達的特征，探索其作為免疫佐劑在生物工程制品中的應用，本實驗從已經構建的pGEM-pIL-18重組載體中克隆出豬IL-18成熟蛋白基因，并在昆蟲細胞中進行了表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒

pGEM-pIL-18重組質粒由本實驗室構建；轉座質粒pFastBacDual和E. coli DH10Bac感受態細胞購自Invitrogen公司。

1.1.2 細胞

SF-9昆蟲細胞由中國科學院武漢病毒研究所王漢中研究員惠贈。

1.1.3 酶類和主要試劑

Ex Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、PstⅠ限制性內切酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；鼠抗豬6×His單克隆抗體和 LipofecttamineTM2000 Reagent購自Invitrogen公司；兔抗豬IL-18單克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP均為 Bioszune公司產品；GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；Grace's培養基和胎牛血清購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計與合成

應用Primer (Version 5.0) 基因分析軟件，參照pGEM-pIL-18基因序列設計一對引物。上游引物5′端引入EcoRⅠ酶切位點和起始密碼子，下游引物5′端引入PstⅠ酶切位點、終止密碼子和6×His標簽序列。上游引物 P1：5′-CGCGAATTC ATGTACTTTGG CAAGCTT-3′；下游引物 P2：5′-CGCCTGCAGTTA3′ (下劃線為酶切位點，粗體為密碼子，加框為6×His標簽序列)。該引物擴增長度為491 bp，含豬IL-18成熟蛋白基因。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 重組載體的構建及鑒定

PCR產物經EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后，克隆到同樣處理的pFastBacDual載體中，轉化E. coli DH5α感受態細胞，提取重組質粒進行PCR鑒定和酶切鑒定，最后將陽性的重組質粒進行測序。

1.2.3 轉染及高滴度重組桿狀病毒的獲得

轉化到含穿梭載體 Bacmid的感受態細胞DH10Bac中，發生轉座作用。按照轉染試劑盒說明書將重組質粒 rBacmid-IL-18轉染生長狀態良好的SF-9昆蟲細胞。待細胞出現明顯病變后收集細胞液，離心取上清作為第1代重組病毒，按1∶10稀釋后，感染處于對數生長期SF-9細胞，27 ℃培養2~3 d，至細胞出現明顯病變時收集上清即得第 2代病毒，用同樣的方法再傳一代，篩選到高滴度的含有豬IL-18基因的重組桿狀病毒。提取DNA，進行PCR鑒定。

1.2.4 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達

收集不同時間1 mL有明顯病變的細胞液，5 000 r/min 離心5 min，沉淀加入80 μL的去離子水懸浮，加入20 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸5 min，進行SDS-PAGE。

1.2.5 表達蛋白的純化和Western blotting檢測

收集表達豬IL-18的病變細胞，PBS (50 mmol/L，pH 7.4) 液懸浮后，超聲波裂解細胞，5 000 r/min離心 5 min。經鎳親和層析柱純化，進行 SDS-PAGE電泳，電轉印至硝酸纖維素膜，將轉印好的 NC膜用5%脫脂乳封閉，然后與兔抗豬IL-18單克隆抗體作用，經TBST 洗滌后與工作濃度的HRP標記羊抗兔IgG作用，最后以DAB顯色，觀察特異性條帶。

1.2.6 表達蛋白的生物學活性測定

分離豬淋巴細胞，用RPMI1640培養液稀釋后，調整細胞濃度到1×105~5×105個/mL，加入純化后的蛋白，使終濃度為200 μg/mL，加入到96孔細胞培養板中培養，第1行每孔50 μL淋巴細胞液，第2、3行設為陰性和空白對照。37 ℃培養48 h，然后每孔加入 20 μL MTT (5.0 mg/mL)，37 ℃繼續培養 4 h，加入100 μL DMSO，混勻，振蕩3 min，以空白對照孔調零為止，用酶標儀測定OD570的值。

2 結果

2.1 良雜豬IL-18基因的PCR擴增

利用 RT-PCR技術擴增 pGEM-pIL-18，經瓊脂糖凝膠電泳初步檢測表明，獲得了 492 bp的DNA條帶，其大小與預期結果一致 (圖1)。

圖1 RT-PCR產物電泳圖Fig. 1 Electrophoresis map for RT-PCR product. M: DL2000 marker; 1, 2: RT-PCR product; 3: negative control.

2.2 重組載體的構建與鑒定

PCR產物經EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后插入到同樣處理的pFastBacDual載體中，構建重組轉座質粒，命名為pFB-IL-18。轉化E. coli JM109感受態細胞，提取重組質粒，進行 PCR擴增，電泳出現有 1條450 bp左右的目的條帶。重組質粒經EcoRⅠ酶切，切出1條大小約為5 700 bp的條帶；經EcoRⅠ和Pst Ⅰ雙酶切，電泳出現2條帶：一條帶為載體，約為5 200 bp，另一條為插入的目的條帶，約為490 bp，與預期結果相符 (圖 2)。序列測序顯示，該轉化菌的質粒中確實含有目的基因片段，且讀碼框正確，表明重組質粒pFB-IL-18構建成功。

圖2 重組轉座質粒的PCR和酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant transfer plasmid by digestion and PCR. M: λ-EcoT 14 I digest; 1: recombinant transfer plasmid digestion by EcoRⅠ+PstⅠ; 2: recombinant transfer plasmid digestion by EcoRⅠ; 3: recombinant transfer plasmid PCR product; m: DL2000 marker.

2.3 轉染后細胞PCR檢測

將 rBacmid-IL-18轉染對數生長期的昆蟲細胞后，分別收集重組桿狀病毒和野生桿狀病毒感染的病變細胞，提取DNA，用M13引物進行PCR擴增，電泳可見重組桿狀病毒在約3 000 bp處出現了特異性條帶，而野生桿狀病毒只在300 bp處出現了特異性條帶 (圖3)，與預期結果一致。

圖3 轉染rBacmid-IL-18后PCR產物鑒定圖Fig. 3 Identification of PCR product after transfected with Bacmid-IL-18. M: λ-EcoT 14 I digest; 1: PCR products of rBacmid-IL-18 with primer M13; 2: PCR products of Bacmid with primer M13; m: DL2000 marker.

2.4 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達

將獲得的第 3代重組病毒接種到處于對數生長期的SF-9細胞，感染2 d后，于不同時間收獲細胞，與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后，煮沸5 min，進行電泳，電泳結果顯示，rBacmid-IL-18重組桿狀病毒在約18 kDa處出現了一條特異性條帶，可見豬IL-18基因在昆蟲細胞中成功得到了表達 (圖4)。

2.5 表達蛋白的純化和Western blotting檢測

收集表達豬IL-18的病變細胞，超聲波裂解后，鎳柱過濾，然后用不同咪唑濃度的洗脫緩沖液進行階段洗脫，SDS-PAGE檢測發現洗脫出了目的條帶(圖 5)，表達的蛋白成功進行了純化。使用兔抗豬IL-18單克隆抗體作為一抗，對上述表達產物進行Western blotting分析，結果表明，重組表達產物可被單克隆抗體所識別，證明本試驗所得的表達蛋白具有特異性，為所需的目的蛋白 (圖5)。2.6 表達蛋白的生物學活性測定

圖4 IL-18蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 4 Analysis of IL-18 protein by SDS-PAGE. M: protein marker; 1-7: IL-18 protein expressed in Sf-9 insect cells.

圖5 純化IL-18蛋白的Western blotting鑒定圖Fig. 5 Identification of purified IL-18 protein by Western blotting. M: protein marker; A1: SDS-PAGE of purified IL-18 protein expressed in Sf-9 insect cells; B1: Western blotting of IL-18 protein expressed in Sf-9 insect cell.

提取豬脾淋巴細胞后，用終濃度為 200 μg/mL的純化蛋白作用48 h，MTT和DMSO作用后，測定OD570的值。結果顯示，加有蛋白的試驗組平均數值0.609±0.017，對照組平均數值為0.303±0.024，試驗組數值明顯高于對照組，差異極顯著 (P＜0.01)。表明豬 IL-18表達蛋白能明顯提高豬淋巴細胞的轉化率，具有較高的生物學活性 (表1)。

3 討論

IL-18是一種強有力IFN-γ誘導劑，其生物學活性主要通過調節 IFN-γ的表達來提高機體的細胞免疫水平。通常情況下，機體內 IL-18表達量甚微，不可能直接提取純化，只有通過基因工程技術才能大量生產重組IL-18。桿狀病毒表達系統是20世紀80年代發展起來的真核基因表達系統[12]，桿狀病毒在昆蟲細胞內復制，昆蟲細胞的蛋白質后加工系統與哺乳動物細胞接近，能識別和切除信號肽[13]，能對表達的真核基因產物更好地進行糖基化、磷酸化、脂肪酶化、酰胺化、切割信號肽以及形成三級或四級結構等[14]。在昆蟲細胞中表達的外源蛋白接近天然蛋白，表達產物的生物學活性、結構與功能特點、抗原性和免疫原性等與天然外源基因產物極其相似[15]。所以，用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統表達豬IL-18非常值得去探索。

表1 豬淋巴細胞轉化試驗結果 (OD570)Table 1 The result of chicken’s lymphocyte transforms test (OD570)

影響蛋白表達量的因素有許多，宿主細胞的生長狀態是影響病毒轉染和蛋白表達的首要因素，生長狀態良好，密度合適的細胞最容易轉染成功，并獲得良好的表達量。培養昆蟲細胞時，培養基里面一般不加抗生素，所以，細胞很容易被細菌、支原體等污染，為了獲得狀態良好的細胞，首先，在培養細胞時要嚴格無菌操作，防止出現污染；其次，由于昆蟲細胞比較脆弱，所以在傳代時要小心輕柔地吹打，最好在吹打前輕輕拍打瓶底，使其自然脫落；最后，轉染時要掌握好細胞的密度和生長狀態。通過反復試驗發現，在轉染前24 h細胞鋪板，當密度達到 70%~80%，細胞處在拉絲狀態時轉染最容易成功。另外，為了獲得較高的表達量，病毒不易傳代過多，一般傳3~5代最好。同時，選擇優良的培養基和胎牛血清對細胞的培養也至關重要。

IL-18的基因克隆與表達已成功，分子結構特點初步明確，在動物試驗階段表現出明顯的免疫增強作用。雖然 IL-18要應用于大規模的生產還有待于進一步的深入研究，但是 IL-18作為疫苗佐劑應用于動物新型疫苗的開發，在提高豬體抗感染力、增強滅活苗或基因工程苗免疫作用方面具有廣闊的應用前景。本研究將編碼豬 IL-18成熟蛋白基因重組于桿狀病毒表達載體中，成功地構建了能夠表達豬IL-18成熟蛋白的重組桿狀病毒。Western blotting表明該病毒表達的豬IL-18成熟蛋白可被兔抗豬IL-18單克隆抗體所識別，這表明用該系統表達的豬IL-18成熟蛋白具有免疫原性和生物學活性。純化后蛋白能明顯促進豬T淋巴細胞轉化，表明所表達的IL-18具有較高的生物活性。此研究為進一步研究豬IL-18功能性蛋白作為分子佐劑在疫苗免疫中的促進作用及開發研制新型免疫增強劑定了基礎。

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Expression of porcine Interleukin-18 in baculovirus/insect cells

Zhenya Wang1,2, Yanbin Wang1,2, Hongying Chen1,2, Panfeng Shao1,2, Xiaodong Ning1, Na Pan1,Lijing Han1, and Baoan Cui1,2
1 College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 Henan Key Laboratory of Animal-Derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China