物理環境影響蛋白質晶體形核的研究進展

陳瑞卿，劉君，鹿芹芹，劉永明，尹大川

西北工業大學生命學院 空間生物實驗模擬技術國防重點學科實驗室，西安 710072

物理環境影響蛋白質晶體形核的研究進展

陳瑞卿，劉君，鹿芹芹，劉永明，尹大川

西北工業大學生命學院 空間生物實驗模擬技術國防重點學科實驗室，西安 710072

物理環境是影響蛋白質晶體形核的重要因素。文中回顧了各種物理環境如光、電場、超聲波、磁場、微重力、溫度、機械振動、異相形核界面對蛋白質晶體形核的影響，并對各物理環境下蛋白質晶體形核的可能機制進行探討，展望了利用物理環境影響蛋白質晶體形核的研究前景。

蛋白質，晶體，形核，物理環境

Abstract:This paper reviews the effects of physical environments (including light, electric field, ultrasound, magnetic field,microgravity, temperature, mechanical vibration, and heterogeneous nucleation interface) on protein crystal nucleation. The research results are summarized and the possible mechanisms of the effects are discussed. In the end of this review, the application prospects of these physical environments (including coupled environments) in protein crystallization are presented.

Keywords:protein, crystal, nucleation, physical environment

X射線單晶衍射技術已經解析了85%以上的已知蛋白質結構 (PDB，www.pdb.org)，是迄今應用最廣泛的生物大分子結構解析技術。該技術需要高質量的蛋白質晶體作為衍射對象，但由于蛋白質晶體的制備困難，所以蛋白質結晶是蛋白質結構解析的“瓶頸”問題之一[1]。蛋白質結晶過程受多參數影響[2-3]，如物理、化學或生化因素等，這些因素影響了蛋白質晶體的形核及生長過程。晶體的形核與生長是蛋白質結晶過程中不可分割的2個階段，其中，形核作為結晶過程中的第一個階段，是獲取蛋白質晶體過程起決定性作用的環節。因此，合理控制蛋白質晶體的形核，不僅可以提高獲得晶體的機會，同時也有利于提高晶體的衍射質量。

蛋白質晶體的形核和生長受到一些物理環境因素的影響，如溫度[4-5]、光[6-7]、電場[8-11]、超聲波[12-13]、磁場[14-16]、微重力[17-18]、機械振動[19]、異相形核界面[20-21]等。重視和把握這些影響蛋白質結晶的因素，有助于獲得高質量的晶體，為蛋白質晶體結構的解析打下基礎。

1 蛋白質晶體的形核

1.1 蛋白質晶體形核的條件

形核是蛋白質分子有序聚集進而形成穩定結晶簇的自發過程。在該過程中，分子需要高度的選擇性和正確的取向[22]。形核需要達到一定的過飽和度，通過蛋白質結晶溶液體系的相圖 (示意如圖1，引自文獻[23])，有助于深入理解形核的過程。從相圖可了解到系統中相關變量 (例如蛋白質濃度、溫度、溶劑特征、pH及離子強度等) 條件下的物質狀態。

圖1 蛋白質結晶溶液體系相圖[23]Fig. 1 Schematic illustration of the phase diagram of protein crystallization solution[23].

從圖1可看出，蛋白質結晶溶液體系相圖一般可分為 4個區域：欠飽和區、亞穩區、形核區和沉淀區。在溶解度曲線以下是欠飽和區，自發的形核不會發生；亞穩區是晶體生長的最佳區域，但在任何合理的時間內都不會自發形核；在形核區，過飽和度足夠大，可以保證自發的形核發生；在沉淀區，由于過飽和度太高，更容易迅速形成沉淀[23-24]。

1.2 蛋白質晶體形核的機理

相比于小分子物質，由于蛋白質分子本身結構的復雜性，其晶體的形核機理相當復雜。上世紀90年代，有關蛋白質晶體形核機理方面的研究比較多[25-26]，但與晶體生長過程相比，形核過程的研究還是很少。這種現狀與形核過程的重要性地位并不相稱。出現這種現象的主要原因在于形核過程的復雜性及深入研究的難度較大。

通常認為，蛋白質晶體形核的驅動力是過飽和度，從自由能角度看，卻不是一個體系自由能降低的過程。下文將分別從過飽和度和體系自由能變化角度來探討形核過程。

1.2.1 過飽和度與形核

Baird等[27]研究了蛋白質晶體形核的機理，提出形核是由過飽和度驅動的。其研究將形核過程中的相對過飽和度 定義為：

式中： 是溶液的相對過飽和度，為無量綱數；c是溶液中蛋白質的質量濃度；sc是蛋白質的溶解度。

在任何時間內蛋白質在系統中均遵循質量守恒定律：

式中：m0是蛋白質的初始質量；V是溶液的體積；t是時間；m1是在一段時間t后晶體從溶液中析出的質量。

將方程 (2) 對時間t求微分有：

此方程的意義可表述為在某一時刻晶體質量的增長率與過飽和度的降低率相關。

由經典的形核理論，晶體生長溶液中出現臨界晶核的速率即形核率 ()Iσ (定義為單位時間單位體積內出現晶核的數量) 可表示為：

由 (4) 式可知過飽和度越大，形核越快，說明適宜大小的過飽和度可驅動蛋白質形核。

與小分子晶體的形核相比，蛋白質晶體形核需要更大的過飽和度，這已經得到了無數事實的支持。出現這種現象的原因，可能與蛋白質分子本身的復雜程度有關，而且因為蛋白質分子需要在溶液中獲得一致取向時才有機會形核，從而使其形核更加困難。

1.2.2 晶體的形核自由能

晶核形成時自由能GΔ的變化，也被認為是形核過程的驅動力，這是從自由能角度而言的觀點。晶核形成時，不僅需要達到一定的臨界尺寸[28]，而且需要越過一定的能量勢壘才能形成穩定的晶核。GΔ依賴于有序堆積聚集體的尺寸，臨界尺寸又與晶核形成時的能壘相關。

Gacia-Ruiz[29]研究了形核過程中能量勢壘的變化。將晶核假定為球形模型 (表面張力不隨方向而改變)，從而推導出形成結晶簇半徑為r時的自由能表達式：

式中：r是結晶簇半徑；v是摩爾體積，定義為晶胞體積與每單位晶胞中分子數之間的比例；k為玻爾茲曼常數；T為體系的絕對溫度；S為溶液的過飽和度，定義為溶液實際的活度 (或濃度) /在平衡時的活度 (或濃度)； 是結晶簇表面的比能，可認為是表面張力。將方程 (5) 對r求導并令導數值為0，可得到臨界晶核半徑*r的表達式：

將 (6) 代入 (5) 式可得達到臨界尺寸晶核時，溶液所需要克服的能量勢壘的表達式：

晶核形成率I即單位體積的晶核數在單位時間內形成臨界晶核的速率可表達為：

式中：B為指前因子，近似為常數，其值很難從理論上得到。B與形成晶核時的化學動力學、溶液的粘性、分子電荷、分子體積和溶液的密度等有關。

根據上述所有公式，可見形核過程與溶液過飽和度之間存在密切的關系。

Durbin和Feher的研究表明[30]，在過飽和的大分子溶液中，如果過飽和度 /sc c超過 1，在正常的結晶條件下，大分子聚集體自由能隨其尺寸增大而增大，當聚集體的尺寸達到一定值，其自由能達到最大，尺寸繼續增加，自由能將開始減小。由于自由能減小過程是一個自發進行的過程，因此，該有序聚集體的繼續生長也相應地自發進行。此時的有序聚集體即為臨界晶核 (即與最大自由能對應時的聚集體半徑為臨界晶核半徑*r)。高過飽和度溶液的形核自由能要明顯低于低過飽和度溶液的形核自由能如圖 2，引自文獻[29])，可見高過飽和度可降低形核勢壘。研究還發現，形成晶核所需要的時間高度依賴于形核勢壘的大小。

圖2 形核自由能隨過飽和度的變化圖[29]Fig. 2 Variation in the free energy as a function of supersaturation[29].

2 各種物理環境下蛋白質晶體的形核

2.1 光

近年來，光照作為影響蛋白質結晶的一個重要因素，越來越受到結晶學家的重視。主要工作集中在：激光和紫外光照射的影響。

利用激光照射蛋白質結晶溶液的研究發現，一定強度飛秒激光照射可以促進蛋白質晶體形核，明顯縮短形核時間，同時提高蛋白質晶體的質量[31-33]。有研究認為，激光促進蛋白質晶體形核的原因是在激光照射下，蛋白質溶液中產生了局部過飽和[34]。

在高過飽和溶液中，自發形核容易產生。利用激光照射，可在低過飽和溶液中形成局部高過飽和區，實現蛋白質在低過飽和度溶液中的形核，從而有利于生長高質量的蛋白質晶體。Sasaki等[32]的研究也佐證了上述觀點：在低過飽和度溶液中，應用傳統的方法 AcrB膜蛋白不會結晶，而在飛秒激光(波長780 nm、脈沖寬度200 fs) 照射下得到了AcrB膜蛋白晶體，生長期為3~5 d。膜蛋白的溶解度非常低，其結晶至今仍很困難，而60%的商業藥物靶向蛋白都是膜蛋白。因此，此技術的發現對于在低過飽和溶液中結晶膜蛋白并提高其質量有很大價值。激光照射不僅對膜蛋白的結晶有重要的價值，對可溶性蛋白的結晶也有重要的影響。Adachi等[35]的研究表明在相同條件下運用傳統方法未得到葡萄糖異構酶、核糖核酸酶晶體，而運用飛秒激光則誘導了葡萄糖異構酶、核糖核酸酶、布氏錐蟲的前列腺素F2a合酶的形核，同時明顯縮短了布氏錐蟲的前列腺素F2a合酶的結晶期。

Okutsu等[6,36]研究了氙燈產生的紫外光對蛋白質結晶的影響，發現紫外照射可促進溶菌酶和核糖核酸酶A的形核。在氙燈照射下測定蛋白質的活性，發現在較短的照射時間內蛋白質的活性不受影響。選用不同波長的氙燈進行照射，發現溶菌酶的形核數量與波長有很大關系，在波長為400 nm時形核數量基本不變，而在波長為280 nm、300 nm時形核數量明顯增加，且在280 nm處的形核數量最大。實驗表明，蛋白質表面的氨基酸殘基 (如絲氨酸、酪氨酸) 在光照下會發生電子躍遷，形成一種中間態，進而形成穩定的二聚體，這通過SDS-PAGE電泳進行了驗證。二聚體會吸引周圍的溶菌酶分子形成穩定臨界尺寸的晶核，從而促進形核。

2.2 電場

帶電物質在電場中會受到電場力作用，蛋白質為兩性物質，在不同pH值下帶有不同電荷，當溶液pH值小于蛋白質等電點 pI時，蛋白質帶正電；反之帶負電，因此蛋白質溶液在電場中時會受到電場力的作用。Taleb等[8]于 1999年報道了電場對溶菌酶結晶的影響，實驗結果表明：在外加電場作用下，溶菌酶晶體數量明顯減少、尺寸增大，晶核形成率顯著降低，且在陰極形核的幾率比較大。對其進行理論分析，可認為，在電場作用下，蛋白質溶液可形成濃度梯度，導致結晶溶液中出現局部過飽和現象，最終影響蛋白質晶體的形核和生長[37]。Al-haq等[38]全面綜述了電場對蛋白質結晶的影響，指出電場對蛋白質晶體的形核及晶體生長過程有很大的影響。

Penkova 等[39]的研究表明，在使用坐滴法的結晶實驗中，電場強度為2~4 kv/cm時，可抑制鐵蛋白質和去鐵鐵蛋白質晶體的形核，在4~6 kv/cm時下卻促進此二者的形核；電場強度為2~6 kv/cm時，可促進溶菌酶晶體的形核。分析原因，認為可能是在外加電場作用下，溶菌酶向陰極移動，溶液中可能會形成濃度梯度，出現局部過飽和，從而促進蛋白質晶核的形成。但當溶質流動較少時，可能反而會抑制晶核的形成。因此，一定的溶質流動速度可能會導致晶體快速形核。

電場對蛋白質結晶的影響是一個涉及多參數的過程，例如結晶的方法、蛋白質的種類、電場強度、電場作用的時間、電極的分布位置及電極數等，因此其對形核的影響比較復雜，當條件適宜時會促進形核，反之會起到抑制的作用。近期Koizumi等[11]的研究表明可以通過改變交流電場的頻率成功控制溶菌酶晶核形成速率，從而影響晶核形成數量。

2.3 超聲波

聲結晶作為聲化工的一個分支，主要是通過超聲波來控制結晶過程的一門新穎技術。聲結晶很早就應用于小分子物質，其作用包括可以縮短形核誘導期、促進晶核形成、改變溶液過飽和度及亞穩區寬度、影響晶體晶型以及控制晶體的尺寸等[40-41]。近 10年來超聲波已成為強化結晶過程的熱點問題之一，然而其對蛋白質結晶的影響卻很少有報道。Luft和 DeTitta[12]曾于 1999年將超聲波用于蛋白質結晶。運用的是超聲波振動可產生能量的原理，使溶液中的聚四氟乙烯珠子移動，將大晶體粉碎為均勻的微小籽晶。將這些微籽晶加入過飽和度低的蛋白質溶液中，就可以實現在亞穩區生長蛋白質晶體。

Kakinouchi等[13]研究了超聲波直接應用于蛋白質結晶時的作用。超聲波應用于結晶過程時會產生較高的能量，超聲的時間及超聲的照射點也會對結晶造成一定的影響。研究發現：一組實驗為在結晶實驗開始后的0 min、超聲照射10 s后的結晶樣品，與未超聲以及超聲作用60 s的對照樣品相比，超聲10 s明顯縮短了誘導形核的時間，促進了形核，產生的晶體數量最多；另一組實驗的處理方式為，在結晶開始后的30 min、超聲照射60 s。與對照相比，這種處理方式得到的樣品其形核所用時間反而增加了，但與未超聲處理的樣品相比，也有促進形核的作用。分析原因，認為可能是由于超聲波打碎了已經形成的結晶簇或晶核，因此延長了形核誘導期。一定條件下的超聲波處理可明顯降低蛋白質形核的誘導期[42]，促進晶核的形成，在不同濃度下有同樣的效應。在該實驗中超聲波加速溶菌酶晶核形成的原因可能是由于其打碎了一些事先已經形成的蛋白質晶體作為新的形核中心，從而減少了形核時間，可見超聲波對蛋白質的作用力大于其分子間的結合能。

2.4 磁場

Yin等[15]研究了磁場中的蛋白質結晶過程，發現蛋白質結晶溶液體系在磁場中會受到磁化力的作用，有可能抑制溶液中的對流和沉降。Sazaki等[14]在 1997年研究了磁場對蛋白質晶體形核和晶體生長的影響，并證實在10 T強磁場下，溶菌酶、鐵蛋白質晶體的形核數減少，同時晶體尺寸增大，且晶體呈現明顯的擇優取向現象。可見磁場作用可以控制蛋白質晶核的數量，對于生長個數少尺寸大的晶體可能是一種很有效的方法。但近期的研究報道給出了相異的結果。如本課題組[43]最近研究發現，在強磁場條件下，順磁溶液中溶菌酶晶體的特異取向會隨著pH值的改變而改變，根據該研究結果，推論得出溶菌酶分子的磁各向異性會受到溶液中 pH值影響，進而影響分子在磁場中的取向。分子在磁場中的共同取向可能有助于分子進行有序排列，從而促進形核。近期Gavira等[44]的研究也得到類似的結果。其研究發現恒定磁場可降低溶菌酶晶核形成的誘導時間，提高晶核的形成密度。當撤去磁場時，相應的效應也隨之消失。這些研究結果表明，磁場可能有助于蛋白質晶體的形核。由于過去的報道互不一致，相關的研究還有待進一步深入進行。

除了恒定磁場，梯度磁場對形核的研究也有報道。Wakayama等[45]發現，當蛋白質結晶溶液處于梯度磁場中的不同位置時，晶核形成會有不同的表現。研究表明，在梯度磁場中，當磁力與所受重力反向時，溶菌酶結晶溶液的重力水平降低 5%，晶體數少于對照組，這可能是由于失重減少了溶液的沉降和對流；當磁場與所受重力同向時，溶菌酶結晶溶液的重力增加 5%，晶體數量多于對照組，這可能是由于超重增加了溶液中的沉降和對流，易形成臨界晶核所致。可見梯度磁場可通過改變重力水平影響晶體生長過程中的沉降和對流，從而影響蛋白質晶體形核及生長過程[46]。

2.5 微重力

蛋白質結晶通常在常重力條件下進行。隨著空間科學及技術的迅速發展，在微重力環境下生長蛋白質晶體成為可能。自上個世紀80年代開始，探空火箭、返回式衛星、空間站等手段被大量用于開展空間蛋白質結晶實驗。一般認為，空間微重力主要通過兩個方面的作用影響蛋白質結晶：一方面，微重力條件下自然對流基本消失。在此情況下，溶質輸運受到限制，從而導致生長中的晶體周邊出現溶質缺乏區，使晶體生長過程中的溶質輸運主要由擴散完成。這被普遍認為是改善晶體質量的主要原因之一。另外一個方面，空間微重力條件下，沉降現象消失。在常重力條件下，研究表明[17]，當晶體尺寸增長到1 μm時，原來在溶液中懸浮的晶體，會在重力作用下發生沉降，從而容易發生晶體之間的融合，導致晶體質量變差。在空間微重力環境中，由于導致沉降的重力因素消失，因此沉降現象消失。這也是解釋晶體質量提高的主要原因之一。

微重力環境對形核的影響方面，研究結果顯示，微重力環境下，晶體形核時間延長，數量減少，尺寸增大[17-18,47]。可見微重力條件下晶體形核的機會是減少的。

過去，受航天活動機會及發射成本等的限制，空間蛋白質結晶僅取得了有限的成功。長遠看，隨著未來空間環境利用的逐步普及，空間蛋白質結晶無論在實際應用還是在繼續深入機理研究方面，均有望迎來新的重要發展。

2.6 溫度

溫度與蛋白質的溶解度具有直接的相關性，對于大部分蛋白質而言，在一定的溫度范圍內，其溶解度隨溫度的升高而增加。但一些蛋白質具有倒溶解度，即溶解度隨溫度的升高而降低。因此溫度可通過調節蛋白質的溶解度從而改變溶液的過飽和度，繼而影響蛋白質晶體形核和生長過程。

以溫度作為推動力，結晶實驗可快速并且可逆地控制過飽和度，影響晶體的數量、尺寸及質量[48-49]。Murai等[5]的研究發現，在相同濃度下，溶菌酶在不同溫度下的形核數有顯著差異。在高濃度的溶菌酶溶液中，低溫下形核數要明顯多于高溫下。在低濃度的溶菌酶溶液中，在溫度升高到一定值時沒有晶體出現，這說明溫度的升高使溶菌酶溶液進入未飽和區，從而無法形核，不能獲得晶體。Lin等[50]研究了不同溫度下10種蛋白質結晶的相圖，通過計算發現改變溫度可控制形核區的面積，進而影響蛋白質晶體的形核與生長。

溫度梯度法是目前普遍應用于結晶的一種方法，當需要解析某種未知結構的蛋白質時，其最佳的結晶溫度尚不明確時，溫度梯度法將是一種很好的選擇，此法可明顯促進形核[51]。Murai等[52]通過計算機來控制冷卻速率，在單一的微孔板上產生許多溫度點，形成在不同冷卻速率下的溫度梯度，將20 ℃下沒有蛋白質晶體生長的溶液進行冷卻，冷卻速率為1.5 ℃~4 ℃/d，用顯微鏡進行觀察，發現快速冷卻條件下可促進形核，冷卻速度慢的條件下晶體數量少尺寸大，以此可成功控制晶體數量及晶體的尺寸。本課題組[4,53]使用溫度掃描的方法對蛋白質結晶進行了篩選，結果表明溫度掃描明顯促進了蛋白質晶體形核，明顯提高了篩選的成功率。溫度梯度法雖然可以通過改變溫度來控制蛋白質晶體的形核，然而溫度變化有一定的局限性，因為并非所有蛋白質對溫度變化都是很敏感的。

2.7 機械振動

事實上，在蛋白質結晶過程中，機械振動總是存在的。但是該環境對蛋白質結晶的影響研究未見報道過。本課題組最近研究了主動機械振動對蛋白質結晶的可重復性及結晶條件篩選成功率的影響[19]。發現在機械振動環境中，低過飽和度條件下的蛋白質晶體形核數量減少；而高過飽和度條件下的蛋白質晶體形核數量與對照組相當，甚至增加。經詳細研究發現，機械振動總體上抑制蛋白質晶體的形核。但是在高過飽和度條件下，足夠高的過飽和度保證了在機械振動下的晶體形核，但是在沒有機械振動的情況下，由于過飽和度高，蛋白質分子聚集太快，最后形成了沉淀，從而使在高過飽和度條件下蛋白質在沒有振動時形核數量反而較低。除了抑制形核外，另一個有趣的發現是，機械振動下生長的蛋白質晶體通常在外觀上看起來更完美，預示其晶體質量可能更好。

2.8 異相形核

MchPerson第一次將異相形核材料用于蛋白質結晶實驗[20]，以此來控制形核時的過飽和度。這一研究意義很大，因為其指出了一種在較低過飽和條件下形核的途徑，非常有利于生長高質量的晶體。此后多種異相形核材料如多孔滲水硅[54]、聚合體膜[55]、脂肪酸薄膜[56]、多微孔合成沸石[57]、功能化處理的云母片[58]、氫氟酸處理的蓋玻片[59]等被用于誘導及控制蛋白質晶體的形核。2009年 Asanithi等[21]第一次將碳納米管薄膜用于蛋白質結晶，研究表明應用這種納米尺度的多孔材料可以控制形核，使在過飽和度低的溶液中生長數量少尺寸大的蛋白質晶體。此技術成功地用于MyBP-C蛋白質的結晶，衍射分辨率達1.6 ?，是傳統結晶方法下獲得最好衍射分辨率的 2倍。這種材料微孔尺寸與晶核的尺寸大小相當，可促進蛋白質晶體的快速形核，是蛋白質晶體形核極好的候選材料。

由于使用異相形核的方法對很多蛋白質的結晶有效，因此，近年來結晶學家一直在尋求一種結晶的通用晶核[60]。2009年Saridakis和Chayen對近年來異相形核多孔材料的研究進行了總結[61]，指出迄今為止最接近于通用晶核的是CaO-P2O5-SiO2(稱作生物玻璃)，這種晶核促進了 14種蛋白質的結晶，其中包括了多種傳統方法難于結晶的蛋白質。然而到目前為止，仍不能說已經找到針對于所有蛋白質結晶的通用晶核。

3 展望

隨著生命科學領域的飛速進展，迫切需要對各類蛋白質的結構進行解析，這對于以蛋白質為靶點的藥物設計是至關重要的，X射線單晶衍射法解析蛋白質結構需要獲得高質量的晶體，形核作為蛋白質結晶的第一步，并對晶體質量起到一定的操控作用，因此形核方法的研究是不容忽視的。

目前對于許多晶體形核方法的機制尚不明確，有待科學家們進一步的探索。新的可控制形核的方法相繼出現，與已有的結晶技術相融合，取得了部分階段性的成果，如磁場與電場的結合對蛋白質晶體形核率的提高，多物理場耦合作用有望成為下一階段蛋白質晶體形核研究的熱點之一。隨著許多新型的異相形核材料用于結晶實驗，通過材料表面的功能化控制晶體形核的數量及時間亦將成為這個領域的研究重點。

REFERENCES

[1] Yin DC, Wakayama NI, Harata K, et al. Formation of protein crystals (orthorhombic lysozyme) in quasi-microgravity environment obtained by superconducting magnet. J Cryst Growth, 2004, 270(1/2): 184–191.

[2] McPherson A. Introduction to protein crystallization.Methods, 2004, 34(3): 254–265.

[3] Li XX, Xu XD, Dan YY, et al. The factors during protein crystallization: a review. Crystallogr Rep, 2008, 53(7):1261–1266.

[4] Zhang CY, Yin DC, Lu QQ, et al. Cycling temperature strategy: a method to improve the efficiency of crystallization condition screening of proteins. Cryst Growth Des, 2008, 8(12): 4227–4232.

[5] Murai R, Yoshikawa HY, Kawahara H, et al. Effect of solution flow produced by rotary shaker on protein crystallization. J Cryst Growth, 2008, 310(7/9): 2168–2172.

[6] Okutsu T. Photochemically-induced crystallization of protein. J Photochem Photobiol C, 2007, 8(3): 143–155.

[7] Kashii M, Hosokawa Y, Kitano H, et al. Femtosecond laser-induced cleaving of protein crystal in water solution.Appl Surf Sci, 2007, 253(15): 6447–6450.

[8] Taleb M, Didierjean C, Jelsch C, et al. Crystallization of proteins under an external electric field. J Cryst Growth,1999, 200(3/4): 575–582.

[9] Hammadi Z, Astier JP, Morin R, et al. Spatial and temporal control of nucleation by localized DC Electric Field. Cryst Growth Des, 2009, 9(8): 3346–3347.

[10] Hou D, Chang HC. ac field enhanced protein crystallization. Appl Phys Lett, 2008, 92(22): 223902.

[11] Koizumi H, Fujiwara K, Uda S. Control of nucleation rate for tetragonal hen-egg white lysozyme crystals by application of an electric field with variable frequencies.Cryst Growth Des, 2009, 9(5): 2420–2424.

[12] Luft JR, DeTitta GT. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules.Acta Cryst D Biol Crystallogr, 1999, 55(Pt 5): 988–993.

[13] Kakinouchi K, Adachi H, Matsumura H, et al. Effect of ultrasonic irradiation on protein crystallization. J CrystGrowth, 2006, 292(2): 437–440.

[14] Sazaki G, Yoshida E, Komatsu H, et al. Effects of a magnetic field on the nucleation and growth of protein crystals. J Cryst Growth, 1997, 173(1/2): 231–234.

[15] Yin DC, Lu HM, Geng LQ, et al. Growing and dissolving protein crystals in a levitated and containerless droplet. J Cryst Growth, 2008, 310(6): 1206–1212.

[16] Surade S, Ochi T, Nietlispach D, et al. Investigations into protein crystallization in the presence of a strong magnetic field. Cryst Growth Des, 2010, 10(2): 691–699.

[17] Kundrot CE, Judge RA, Pusey ML, et al. Microgravity and macromolecular crystallography. Cryst Growth Des, 2001,1(1): 87–99.

[18] Snell EH, Helliwell JR. Macromolecular crystallization in microgravity. Rep Prog Phys, 2005, 68(4): 799–853.

[19] Lu QQ, Yin DC, Liu YM, et al. Effect of mechanical vibration on protein crystallization. J Appl Crystallogr,2010, 43(3): 473–482.

[20] McPherson A, Shlichta P. Heterogeneous and epitaxial nucleation of protein crystals on mineral surfaces.Science, 1988, 239(4838): 385–387.

[21] Asanithi P, Saridakis E, Govada L, et al. Carbon-nanotubebased materials for protein crystallization. Acs Appl Mater Interfaces, 2009, 1(6): 1203–1210.

[22] Nanev CN. How do crystal lattice contacts reveal protein crystallization mechanism? Cryst Res Technol, 2008,43(9): 914–920.

[23] Chayen NE. Methods for separating nucleation and growth in protein crystallisation. Prog Biophys Mol Biol, 2005,88(3): 329–337.

[24] Navarro A, Wu HS, Wang SS. Engineering problems in protein crystallization. Sep Purif Technol, 2009, 68(2):129–137.

[25] Ataka M. Nucleation and growth kinetics of hen egg-white lysozyme crystals. Prog Cryst Growth Charact Mater,1995, 30(2/3): 109–128.

[26] Saikumar MV, Glatz CE, Larson MA. Lysozyme crystal growth and nucleation kinetics. J Cryst Growth, 1998,187(2): 277–288.

[27] Baird JK, Hill SC, Clunie JC. Kinetics of protein crystal nucleation and growth in the batch method. J Cryst Growth, 1999, 196(2/4): 220–225.

[28] Feher G. Mechanisms of nucleation and growth of protein crystals. J Cryst Growth, 1986, 76(3): 545–546.

[29] Garcia-Ruiz JM. Nucleation of protein crystals. J Struct Biol, 2003, 142(1): 22–31.

[30] Durbin SD, Feher G. Protein crystallization. Annu Rev Phys Chem, 1996, 47(1): 171–204.

[31] Yoshikawa HY, Murai R, Sugiyama S, et al. Femtosecond laser-induced nucleation of protein in agarose gel. J Cryst Growth, 2009, 311(3): 956–959.

[32] Sasaki T, Mori Y, Kawamura F, et al. New developments in crystal growth from solutions: oxides, proteins, and nitrides. J Cryst Growth, 2008, 310(7/9): 1288–1297.

[33] Murai R, Yoshikawa HY, Takahashi Y, et al. Enhancement of femtosecond laser-induced nucleation of protein in a gel solution. Appl Phys Lett, 2010, 96(4): 043702.

[34] Nakamura K, Sora Y, Yoshikawa HY, et al. Femtosecond laser-induced crystallization of protein in gel medium.Appl Surf Sci, 2007, 253(15): 6425–6429.

[35] Adachi H, Takano K, Hosokawa Y, et al. Laser irradiated growth of protein crystal. Jpn J Appl Phys, 2003, 42(7B):L798–L800.

[36] Furuta K, Horiuchi H, Hiratsuka H, et al. Photochemically induced nucleation of ribonuclease A enhanced by a stable protein dimer produced from the photochemical reaction of Tyr residual groups. Cryst Growth Des, 2008, 8(6):1886–1889.

[37] Hammadi Z, Veesler S. New approaches on crystallization under electric fields. Prog Biophys Mol Biol, 2009,101(1/3): 38–44.

[38] Al-haq MI, Lebrasseur E, Tsuchiya H, et al. Protein crystallization under an electric field. Crystallogr Rev,2007, 13(1): 29–64.

[39] Penkova A, Gliko O, Dimitrov IL, et al. Enhancement and suppression of protein crystal nucleation due to electrically driven convection. J Cryst Growth, 2005,275(1/2): e1527–e1532.

[40] Luque de Castro MD, Priego-Capote F. Ultrasoundassisted crystallization (sonocrystallization). Ultrason Sonochem, 2007, 14(6): 717–724.

[41] Virone C, Kramer HJM, van Rosmalen GM, et al. Primary nucleation induced by ultrasonic cavitation. J Cryst Growth, 2006, 294(1): 9–15.

[42] Nanev CN, Penkova A. Nucleation of lysozyme crystals under external electric and ultrasonic fields. J Cryst Growth, 2001, 232(1/4): 285–293.

[43] Yin DC, Geng LQ, Lu QQ, et al. Multiple orientation responses of lysozyme crystals to magnetic field when paramagnetic salts are used as the crystallization agents.Cryst Growth Des, 2009, 9(12): 5083–5091.

[44] Gavira JA, Garcia-Ruiz JM. Effects of a magnetic field on lysozyme crystal nucleation and growth in a diffusive environment. Cryst Growth Des, 2009, 9(6): 2610–2615.

[45] Wakayama NI, Ataka M, Abe H. Effect of a magnetic field gradient on the crystallization of hen lysozyme. J Cryst Growth, 1997, 178(4): 653–656.

[46] Sazaki G. Crystal quality enhancement by magnetic fields.Prog Biophys Mol Biol, 2009, 101(1/3): 45–55.

[47] Han Y, Cang HX, Zhou JX, et al. Protein crystal growth on board Shenzhou 3: a concerted effort improves crystal diffraction quality and facilitates structure determination.Biochem Biophys Res Commun, 2004, 324(3): 1081–1086.

[48] Christopher GK, Phipps AG, Gray RJ. Temperaturedependent solubility of selected proteins. J Cryst Growth,1998, 191(4): 820–826.

[49] McPherson A. Crystallization of proteins by variation of pH or temperature. Methods Enzymol, 1985, 114: 125–127.

[50] Lin YB, Zhu DW, Wang T, et al. An Extensive study of protein phase diagram modification: increasing macromolecular crystallizability by temperature screening. Cryst Growth Des, 2008, 8(12): 4277–4283.

[51] D'Arcy A, Mac Sweeney A, Stihle M, et al. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Cryst D Biol Crystallogr, 2003, 59(Pt 2): 396–399.

[52] Murai R, Nakata S, Kashii M, et al. Cooling-rate screening system for determining protein crystal growth conditions.J Cryst Growth, 2006, 292(2): 433–436.

[53] Wang XK, Yin DC, Zhang CY, et al. Effect of temperature programmes on protein crystallisation. Cryst Res Technol,2010, 45(5): 479–489.

[54] Chayen NE, Saridakis E, El-Bahar R, et al. Porous silicon:an effective nucleation-inducing material for protein crystallization. J Mol Biol, 2001, 312(4): 591–595.

[55] Fermani S, Falini G, Minnucci M, et al. Protein crystallization on polymeric film surfaces. J Cryst Growth,2001, 224(3/4): 327–334.

[56] Kubo T, Hondoh H, Nakada T. Impurity effects on orientation of lysozyme crystals nucleated on fatty acid thin films. J Cryst Growth, 2008, 310(7/9): 1744–1748.

[57] Sugahara M, Asada Y, Morikawa Y, et al. Nucleantmediated protein crystallization with the application of microporous synthetic zeolites. Acta Cryst D Biol Crystallogr, 2008, 64(Pt 6): 686–695.

[58] Tosi G, Fermani S, Falini G, et al. Crystallization of proteins on functionalized surfaces. Acta Cryst D Biol Crystallogr, 2008, 64(Pt 10): 1054–1061.

[59] Guo YZ, Yin DC, Lu QQ, et al. Enhancement of nucleation during hanging drop protein crystallization using HF Treatment of cover glasses. Cryst Res Technol,2010, 45(2): 158–166.

[60] Chayen NE. Turning protein crystallisation from an art into a science. Curr Opin Struc Biol, 2004, 14(5):577–583.

[61] Saridakis E, Chayen NE. Towards a 'universal' nucleant for protein crystallization. Trends Biotechnol, 2009, 27(2):99–106.

Effects of physical environments on nucleation of protein crystals: a review

Ruiqing Chen, Jun Liu, Qinqin Lu, Yongming Liu, and Dachuan Yin
Key Laboratory for Space Bioscience & Biotechnology, School of Life Sciences, Northwestern Polytechnic University, Xi’an 710072, China

Received: May 27, 2010; Accepted: September 20, 2010

Supported by: Health and Science Foundation of Health Department of Jiangsu Province (No. H200914).

Corresponding author: Yehan Zhu. Tel: +86-512-67780353; E-mail: zhuyehansz@sina.com

江蘇省衛生廳衛生科技發展項目 (No. H200914) 資助。