流加菌種對厭氧氨氧化工藝的影響

唐崇儉，鄭平，陳建偉

浙江大學環境工程系，杭州 310029

流加菌種對厭氧氨氧化工藝的影響

唐崇儉，鄭平，陳建偉

浙江大學環境工程系，杭州 310029

厭氧氨氧化工藝具有很高的容積氮去除速率，現已成功應用于污泥壓濾液等含氨廢水的脫氮處理，容積氮去除速率高達9.5 kg/(m3·d)。但由于厭氧氨氧化菌為自養型細菌，生長緩慢，對環境條件敏感，致使厭氧氨氧化工藝啟動時間過長，運行容易失穩，并且不適合處理有機含氨廢水和毒性含氨廢水，極大地限制了該工藝的進一步推廣應用。為了克服厭氧氨氧化工藝實際應用中存在的問題，結合發酵工業中常用的菌種流加技術，提出了一種新型的菌種流加式厭氧氨氧化工藝，研究了該新型工藝在厭氧氨氧化工藝的啟動過程、穩定運行以及處理有機含氨廢水和毒性含氨廢水等方面的應用情況。結果表明，通過向反應器內補加優質厭氧氨氧化菌種，可提高厭氧氨氧化菌數量及其在菌群中的比例，強化厭氧氨氧化功能。據此研發的菌種流加式厭氧氨氧化工藝不僅可以實現快速啟動，而且可以穩定運行，并突破了有機物和毒物所致的運行障礙，拓展了厭氧氨氧化工藝的應用范圍。

厭氧氨氧化，菌種流加技術，生物脫氮，有機物，毒物

Abstract:Anaerobic ammonium oxidation (Anammox) process is a high-rate nitrogen removal technology that has been applied in sludge dewatering effluents treatment with nitrogen removal rate as high as 9.5 kg/(m3·d). However, due to the slow growth rate of the autotrophic Anammox bacteria and the susceptivity to environmental conditions, the start-up of Anammox process is very long;the operation is unstable; and the nitrogen removal from organic-containing and/or toxicant-containing ammonium-rich wastewaters using Anammox process becomes difficult. Thus, the application of this high-rate process is significantly limited. In this paper, a newly-developed Anammox process with sequential biocatalyst (Anammox biomass) addition was established based on the procedure in fermentation engineering. We introduced the Anammox process with sequential biocatalyst addition on start-up, stable operation and the treatment of organic-containing and toxicant-containing ammonium-rich wastewaters. Results show that supplementing high-activity Anammox biomass into reactors will increase the amount of as well as the ratio of Anammox bacteria. Thus, the innovative Anammox process with sequential biocatalyst addition not only accelerates the start-up course, but also enhances the stability of Anammox process. Furthermore, it overcomes the drawbacks of wastewaterscontaining high organic content and toxic substances. Therefore, the application of Anammox process may be further enlarged.

Keywords:Anammox, sequential biocatalyst addition, biological nitrogen removal, organic matter, toxic substance

厭氧氨氧化 (Anaerobic ammonium oxidation，Anammox) 是近 20年中開發成功的一種高效生物脫氮技術[1-3]，其最高容積去除速率可達50.75 kg/(m3·d)[4]。2002年世界上第一個生產性 Anammox反應器在荷蘭鹿特丹投入運行，用于處理厭氧消化污泥壓濾液，容積去除速率高達 9.5 kg/(m3·d)[3]，對于一個 62萬人口的城市，其污泥消化液處理僅用了70 m3裝置。Anammox工藝的效能大大突破了傳統硝化-反硝化生物脫氮工藝，受到了環境工程界的高度關注；其處理費用僅為0.75 歐元/kg N，遠遠低于傳統生物脫氮工藝 (2~5歐元/kg N)[5]，顯示了誘人的應用前景。

但是，厭氧氨氧化菌為嚴格化能自養菌，其倍增時間長達11~19 d[3,6]，細胞產率僅為0.11 g VSS/g NH4+-N[7]，Anammox菌擴增困難，導致反應器啟動過程十分緩慢，前述第一個生產性Anammox反應器的啟動過程長達3.5年[3]。由于厭氧氨氧化菌為自養菌，當環境中存在有機物時，其基質亞硝酸鹽易受反硝化菌的競爭[8-9]。厭氧氨氧化菌對環境條件 (如水質、溫度) 敏感[10-12]，對毒性物質適應能力較差[12-13]。迄今為止，厭氧氨氧化工藝的應用僅局限于少數幾種低C/N和易生物處理的廢水。含氨廢水同時含有機物 (如味精廢水[14]) 或毒性物質 (如制藥廢水[12])是普遍現象，因此突破上述過程瓶頸對厭氧氨氧化工藝的推廣應用具有重大的現實意義。

菌種擴大培養是發酵工業中廣泛采用的一種菌種應用技術[15]。在批次發酵中，一般通過“試管→三角瓶→種子罐→發酵罐”的多級擴增，使菌量滿足生產需要。而在連續發酵中，菌種擴增與發酵生產往往同時進行。在厭氧氨氧化工藝的啟動過程中，除裝置內菌種自身增殖外，外加菌種無疑有利于加快菌體積累。在厭氧氨氧化工藝用于處理高濃度有機含氨廢水或者毒性含氨廢水時，外加菌種則無疑有助于保持功能菌數量及其在混合菌群 (污泥) 中的比例，從而增強對有機物和毒物的抗性。基于這一理念，本課題組開發了新型菌種流加式厭氧氨氧化工藝[16]，并進行了相關試驗，以下對此方面的研究進展進行了綜述。

1 有機物對厭氧氨氧化工藝的影響

在豬場廢水、味精廢水和水產養殖廢水等眾多實際廢水中，有機物與氨共存。不同有機物對厭氧氨氧化工藝的影響不盡相同，如甲醇、酚類等毒性有機物對厭氧氨氧化菌的抑制作用十分強烈[17-18]，筆者將其歸入毒性物質。常見的無毒可溶性有機物如葡萄糖、乙酸、丙酸、丁酸等對厭氧氨氧化工藝的影響主要可歸結為反硝化作用[8-9]。本文擬從分子水平、細胞水平以及生態水平等層面來探討無毒有機物對厭氧氨氧化工藝的影響。

從分子水平看，亞硝酸是厭氧氨氧化和反硝化的共同反應物，兩者的化學反應式分別為 (1) 和(2) (其中有機物以葡萄糖表示)[19]。在缺氧以及同時存在氨、亞硝酸鹽和有機物的條件下，因反硝化的吉布斯自由能 (?472 kJ/mol) 低于厭氧氨氧化(?335 kJ/mol) 的吉布斯自由能，反硝化更易發生，因此反應物亞硝酸被優先用于反硝化，導致厭氧氨氧化因缺乏反應物亞硝酸而難以進行。

從細胞水平看，反硝化菌的倍增時間一般以小時計，而厭氧氨氧化菌的倍增時間則一般以天計[20]，前者遠遠短于后者。由于反硝化先于厭氧氨氧化發生，因此體系內的營養物質 (包括亞硝酸) 也優先滿足反硝化菌的細胞合成之需。在實際廢水中，一些營養成分 (如微量元素和生長因子) 的含量較低，易成為限制性因子，有異養菌生長時，這些限制性因子供求關系更加緊張，對厭氧氨氧化菌的生存和發展是一個嚴峻挑戰。

從生態水平看，反硝化菌為異養型細菌，可利用有機物作為碳源，其細胞產率 (細胞產率系數Y=0.3) 遠遠高于厭氧氨氧化菌 (Y=0.066)[9,19-20]，因而在生存空間 (顆粒污泥空間、反應器有效空間) 的競爭中也處于優勢[9]。若長期在高有機物濃度下運行，反硝化菌可逐漸占據顆粒污泥和反應器的有效空間，并將厭氧氨氧化菌排擠出反應器系統[9]。

Chamchoi等[8]的研究結果表明，在UASB反應器容積氮負荷低于0.1 kg/(m3·d)的工況下，進水COD濃度提高至300 mg/L[有機負荷為0.1~0.2 kg COD/(m3·d)]即可抑制厭氧氨氧化菌混培物的活性。Molinuevo等[20]也證實，COD濃度為292 mg/L可導致厭氧氨氧化反應器性能嚴重惡化。楊洋等[21]研究表明葡萄糖 (200 mg COD/L) 可明顯抑制污泥的厭氧氨氧化活性，污泥表現出較高的反硝化活性。本課題組研究表明，長期在高濃度有機物 (COD/NO2?-N為2.29)下運行，厭氧氨氧化反應器的容積脫氮效能可由11.70 kg/(m3·d)直線下降至 0.1~0.3 kg/(m3·d)，最后幾近消失 (通過厭氧氨氧化消耗的 NO2?-N 僅為2.1%)[9]。長期 (130 d) 在高濃度有機物下運行后，即使從廢水中去除有機物，恢復在無機狀態下運行(持續運行18 d)，厭氧氨氧化反應器的容積效能也不能恢復至原有水平[9]。這一現象表明，有機物已對厭氧氨氧化工藝的脫氮功能產生了深刻的影響。采用透射電鏡對比觀察反應器內的污泥樣品發現，添加有機物后，污泥中的厭氧氨氧化菌細胞顯著下降(圖1中A、B為未添加有機物前的污泥樣品；C、D、E、F為添加有機物長期運行后的污泥樣品)，大量厭氧氨氧化細胞處于分解狀態 (圖 1E、F)[9]。有機物對厭氧氨氧化菌的影響可歸因為：反硝化菌優先利用亞硝酸鹽，致使厭氧氨氧化菌缺乏基質而處于饑餓狀態，反硝化菌逐漸在反應器內占據主導地位，導致厭氧氨氧化功能最終消失[9]。

圖1 添加有機物前后污泥樣品的透射電鏡照片[9]Fig. 1 TEM photographs of sludges before (A, B) and after (C,D, E, F) dosing organic matter[9].

2 毒性物質對厭氧氨氧化工藝的影響

從分子水平看，毒性物質對厭氧氨氧化的影響主要有 2個方面：一是與厭氧氨氧化競爭反應物氨或亞硝酸，如在脫氮硫桿菌的作用下廢水中的硫化物可將亞硝酸還原為氮氣[22]；又如在硝化細菌的作用下氧可將氨氧化成亞硝酸而造成氨缺乏，也可將亞硝酸氧化成硝酸而造成亞硝酸缺乏[23]。二是導致催化厭氧氨氧化反應的酶失活，如羥胺氧還酶中含有大量細胞色素[23]，CN?可與細胞色素中的鐵結合而使之失活。

從細胞水平看，毒物會破壞厭氧氨氧化菌的細胞結構或抑制厭氧氨氧化菌的代謝活動[13]。抗生素是含氨制藥廢水中常見的抑制物質[12-13]，其中青霉素、頭孢菌素類、萬古霉素等可干擾細胞壁的合成；鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、四環素等可干擾核糖體的蛋白質合成[24]。

從生態水平看，厭氧氨氧化菌生長速度慢、細胞產率低、對毒性物質抗性弱；而異養菌生長速度快、細胞產率高、對毒性物質抗性強。當廢水中存在毒性物質時，厭氧氨氧化菌所受的抑制更嚴重，更易被淘汰。

我國抗生素生產業發展迅猛，現有 300多家抗生素生產企業，生產70多個抗生素品種，產量占世界原料藥產量的 20%~30%。抗生素可抑制厭氧氨氧化菌的活性。van de Graaf等[7]通過批次實驗研究了氯霉素對厭氧氨氧化污泥活性的影響，結果表明氯霉素添加量為200 mg/L時，厭氧氨氧化活性降低了 68%。Fernández等[13]的研究結果表明，四環素濃度為10 mg/L可導致反應器內厭氧氨氧化菌的活性降低60%。含氨制藥廢水因含有殘余的抗生素，采用厭氧氨氧化工藝處理時，效果往往較差。本課題組的研究表明，采用厭氧氨氧化工藝直接處理制藥廢水 (進水氨氮、亞硝氮濃度為 120~250 mg/L)時，反應器的厭氧氨氧化脫氮功能逐漸下降，至41 d后完全消失。生物毒性試驗表明，制藥廢水的生物毒性是導致反應器厭氧氨氧化功能消失的主要原因[12]。隨著運行時間的延長，毒性物質可在厭氧氨氧化污泥中積累而呈現蓄積毒性[12]，更加重了毒性物質對厭氧氨氧化菌的抑制，反應器的脫氮性能最終完全崩潰。

3 菌種流加式厭氧氨氧化技術

菌種流加式厭氧氨氧化技術是針對常規厭氧氨氧化工藝的固有缺陷而開發的一種新型廢水生物脫氮技術[16]，本課題組對該技術進行了初步探究。

3.1 加速啟動過程

厭氧氨氧化反應器的啟動緩慢，這一缺陷嚴重制約了該工藝的工程化應用。采用菌種流加技術可大大縮短厭氧氨氧化工藝的啟動時間[10]。

在本課題組所做的厭氧氨氧化反應器啟動研究中，中試厭氧氨氧化反應器采用上流式濾器(2.5 m3)，接種污泥為普通活性污泥 (短程硝化污泥、厭氧顆粒污泥、反硝化污泥以及厭氧絮體污泥)，由于在常溫下啟動，反應器運行200 d后仍未見氨氮去除現象[10]。為了縮短啟動時間，于第214天向反應器內投加了 20 L高效厭氧氨氧化污泥[VSS為14.2 g/L，比污泥活性為1.68 g/(gVSS·d)]，中試反應器立即呈現厭氧氨氧化功能，之后氨氮去除率逐漸上升，厭氧氨氧化功能逐漸增強。至第 255天，反應器容積總氮去除速率升高為1.11 kg/(m3·d)，達到設計指標值，反應器啟動成功[10]。后續運行結果表明，該中試厭氧氨氧化反應器的容積脫氮效能可達3.5 kg/(m3·d)[25]。

就污泥投加量而論，相對于中試裝置內的污泥量，所投加的厭氧氨氧化污泥并不多 (污泥投加比約為2%)[10]，理論上不足以產生如此顯著的功效。這個現象表明，經過 200多天的運行，中試反應器內已積累一定數量的厭氧氨氧化菌，只是由于某些因素的限制而不能顯現厭氧氨氧化功能。

實驗證明，厭氧氨氧化菌富集培養物只有在細胞密度高達 1010個/mL以上時，才能顯現出厭氧氨氧化活性[23]。在該中試反應器的啟動過程中 (2007年10月至2008年5月)，水溫維持在較低水平 (5 ℃~20 ℃)，在此溫度下，厭氧氨氧化的活化能高達93~94 kJ/mol[11]，反應較難進行(在廢水生物處理中，活化能的取值范圍通常為8.37~83.68 kJ/mol[23])，故厭氧氨氧化菌的細胞密度難以提高，這可能是導致該中試厭氧氨氧化反應器啟動過程持續時間很長的主要原因。通過向該中試反應器補充高活性厭氧氨氧化菌種，可在中試反應器的局部空間內提高厭氧氨氧化菌的細胞密度，從而顯現出厭氧氨氧化活性，進而帶動了中試反應器內其他厭氧氨氧化菌的代謝作用，最終得以在較短時間內完成啟動，菌種流加效應顯著[10]。

3.2 加速失穩恢復

厭氧氨氧化菌的基質為氨和亞硝酸鹽，均具毒性，其中尤以亞硝酸鹽毒性更大。在反應器運行過程中，當基質濃度較高時，容易出現基質的自抑制而導致反應器運行失穩。厭氧氨氧化反應器基質抑制后的性能恢復是工藝穩定運行的重要內容。

Strous等[6]研究表明，亞硝酸鹽濃度達98 mg/L時即可完全抑制厭氧氨氧化菌的活性。Kimura等[26]研究了亞硝酸鹽沖擊對厭氧氨氧化反應器性能的影響，發現當進水亞硝酸鹽濃度突然提高至750 mg/L，并在此濃度下維持7 d，反應器內厭氧氨氧化菌活性降低為原來的10%。此外，研究還表明游離氨濃度達80~104 mg/L時，也能導致厭氧氨氧化反應器運行性能的惡化[27]。本課題組研究表明，當厭氧氨氧化反應器的進水濃度提升為1 100 mg/L (進水氨氮為1 000 mg/L) 時，反應器出水濃度逐漸升高為 703 mg/L，出水濃度升高為716 mg/L；和去除率分別僅為28%和36%，反應器性能嚴重惡化。將基質濃度降低后進行恢復試驗，運行39 d后反應器的進水亞硝酸鹽濃度僅能恢復至800 mg/L，恢復程度只有89%。筆者在后續研究中，當反應器發生基質自抑制時，通過向反應器內流加少量高效厭氧氨氧化菌種，即可有效緩解基質的自抑制作用，快速恢復厭氧氨氧化反應器的脫氮性能。

3.3 克服有機物影響

本課題組研究了菌種流加式厭氧氨氧化工藝處理有機含氨廢水的運行性能，實驗結果如圖2所示。兩個平行運行的序批式反應器 (分別記為 R1和R2)，其中R1不流加菌種，作為對照；R2每日定時流加菌種[比厭氧氨氧化活性為1.9 g/(g VSS·d)]，流加速率為0.097 g VSS/(L廢水·L反應器·d)，進水氨氮、亞硝酸鹽濃度為350 mg/L和400 mg/L，有機物濃度為 500 mg COD/L，COD/為 1.25，HRT為24 h。在前15天，由于未對反應器內的pH值進行控制，體系內pH值高達9.0~9.3 (主要由反硝化所致)。與此對應，2個反應器的氨氮去除率較低，但R2反應器的氨氮、亞硝酸鹽氮的去除率均高于R1。適時調控 pH值后，2個反應器內的 pH值穩定在7.5~8.0，R2反應器的氨氮去除率上升至70%~80%，厭氧氨氧化功能顯著增強；而R1的氨氮去除率仍維持在20%以下，厭氧氨氧化功能較弱。以上結果表明，采用菌種流加技術可有效克服有機物對厭氧氨氧化的負面影響。

3.4 緩解毒物影響

本課題組試驗了菌種流加式厭氧氨氧化工藝處理制藥廢水 (含多種抗生素) 的性能。圖 3為對照UASB反應器 (未采用菌種流加技術) 的運行性能，由圖 3可見，在制藥廢水氨氮和亞硝酸鹽濃度分別為120~200 mg/L和160~240 mg/L，HRT設置為16 h時，反應器的出水氨氮和亞硝酸鹽濃度均高達150~200 mg/L，氨氮去除率甚至低于20%，容積氮去除速率僅為 0.1 kg/(m3·d)。而采用菌種流加技術[菌種流加速率為0.028 gVSS/(L廢水·L反應器·d)]，厭氧氨氧化反應器的HRT可逐漸縮短為1.11 h，反應器出水氨氮濃度低于50 mg/L (圖4A)，氨氮去除率穩定在80%左右；出水亞硝酸鹽濃度基本穩定在20 mg/L以下(圖4A)，亞硝酸鹽去除率為90%；反應器的容積負荷高達8.0~9.4 kg/(m3·d)，容積去除速率達7.9 kg/(m3·d) (圖4B)。上述結果表明，采用菌種流加式厭氧氨氧化工藝，可實現制藥廢水等有毒含氨廢水的高效生物脫氮。

圖2 存在有機物時厭氧氨氧化SBR的運行性能Fig. 2 Performance of Anammox SBR in the presence of organic content. R1: without biocatalyst addition; R2: with biocatalyst addition.

圖3 厭氧氨氧化工藝直接處理制藥廢水的運行性能Fig. 3 Performance of conventional Anammox process treating pharmaceutical wastewater. Eff.: effluent.

圖4 菌種流加式厭氧氨氧化工藝處理制藥廢水的運行性能Fig. 4 Performance of Anammox process with sequential biocatalyst addition. (A) Profile of influent and effluent nitrogen concentration and hydraulic retention time (HRT). (B) Profile of nitrogen loading rate and nitrogen removal rate. Eff.: effluent; Inf.: influent.

綜合來看，基質、有機物和毒性物質都會對厭氧氨氧化菌產生抑制，導致厭氧氨氧化反應器的脫氮性能失穩。如前所述，作為毒物，這些物質均可從分子水平、細胞水平和生態水平影響厭氧氨氧化，其中尤以直接破壞厭氧氨氧化菌的細胞更為強烈。在處理含氨制藥廢水的過程中，經41 d的連續運行，UASB反應器內的厭氧氨氧化顆粒污泥逐漸解體，顆粒粒徑由2.51 mm降低為1.49 mm，污泥顏色由鮮紅色轉變為淺黃色；通過透射電鏡觀察，發現污泥中厭氧氨氧化菌的細胞數量銳減。同樣，高濃度的亞硝酸鹽也會對厭氧氨氧化菌產生強烈的毒害作用，由于厭氧氨氧化性能的恢復往往是通過厭氧氨氧化菌數量增多來實現，而在基質抑制條件下，厭氧氨氧化菌難以增長，導致反應器性能失穩后的恢復過程十分緩慢。存在無毒有機物的工況下，由于反硝化作用以及反硝化菌的特性，厭氧氨氧化菌在基質 (分子水平)、營養 (細胞水平) 以及生存空間(生態水平) 的競爭中都處于絕對劣勢[9]，長期在高有機物濃度下運行，厭氧氨氧化菌容易被淘汰出反應器系統[9]。可見，無論是發生基質自抑制，還是因毒物和有機物存在而導致的性能惡化，都使得厭氧氨氧化菌的數量不能滿足需求。通過流加高活性厭氧氨氧化菌種，可人為增加反應器內厭氧氨氧化菌的數量，從而強化脫氮功能。另外，厭氧氨氧化菌可分泌大量胞外多聚物[4]，可使厭氧氨氧化菌大量聚集，容易形成沉淀性能優良的厭氧氨氧化顆粒污泥[4]，并具有較高活性[1.9 g/(g VSS·d)][4]，同時也具有較強抵抗外界不利因素影響的能力[9,28]。因此，通過流加高活性、沉淀性能優良的厭氧氨氧化顆粒污泥，可增加體系中厭氧氨氧化菌的數量，實現厭氧氨氧化菌的有效持留，并能增強其抵抗外界不利因素影響的能力，最終發揮出菌種流加的效應。

4 結論與展望

厭氧氨氧化可在厭氧條件下實現對廢水中氨和亞硝酸鹽的同時去除，具有較高的容積去除效能和較低的運行費用，是目前廢水生物脫氮技術的研究熱點。但由于厭氧氨氧化菌倍增時間長、細胞產率低、且對環境條件敏感、反應器啟動時間長、運行易失穩、難以應用于高濃度有機含氨廢水和毒性含氨廢水的生物脫氮，嚴重限制了該工藝的應用范圍。基于菌種流加技術的菌種流加式厭氧氨氧化工藝不僅可加快厭氧氨氧化工藝的啟動和失穩后的恢復，而且可克服有機物和毒物所致的負面影響，實現制藥廢水等有機毒性含氨廢水的高效脫氮，具有誘人的開發潛力。在后續研究中，宜深入研究厭氧氨氧化菌的生長和代謝動力學特性，獲得菌種流加的定量參數；以現代分子生物學技術為手段，建立菌群動態變化指示系統；引進自動化控制技術，實現對該技術過程的自動化控制。

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Effect of sequential biocatalyst addition on Anammox process

Chongjian Tang, Ping Zheng, and Jianwei Chen
Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China

Received: April 26, 2010; Accepted: August 27, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 10772150), New Century Excellent Talents in University (No. NCET-06-0885),Ph.D Programs Foundation of the Ministry of Education of China (No. 200806990011), Fundamental Research Foundation of Northwestern Polytechnical University in China (No. 3).

Corresponding author: Dachuan Yin. Tel/Fax: +86-29-88460254; E-mail: yindc@nwpu.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 10772150)，新世紀優秀人才支持計劃 (No. NCET-06-0885)，國家博士點基金 (No. 200806990011)，西北工業大學基礎科研重點項目 (No. 3) 資助。