小麥種子過氧化物酶WP1基因的原核表達、純化及多克隆抗體制備

單麗偉，唐如春，劉三陽，范三紅,2，郭藹光,2

1 西北農林科技大學生命科學學院，楊凌 712100

2 陜西省農業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100

小麥種子過氧化物酶WP1基因的原核表達、純化及多克隆抗體制備

單麗偉1，唐如春1，劉三陽1，范三紅1,2，郭藹光1,2

1 西北農林科技大學生命科學學院，楊凌 712100

2 陜西省農業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100

WP1是小麥種子中最主要的陽離子過氧化物酶，該酶不僅參與種子的發(fā)育過程，而且影響面粉的加工品質。首先構建了WP1基因原核表達載體pET28a-WP1，并將其轉化到T7 Expression大腸桿菌菌株中誘導表達。His-tag融合的WP1主要以包涵體形式存在，使用Ni-NTA親和層析柱在變性條件下進行純化，獲得純度大于98%的重組蛋白。重組WP1經尿素梯度透析復性溶解后免疫新西蘭大白兔，最終獲得WP1多克隆抗體。ELISA分析結果顯示制備的WP1兔抗血清的效價大于1∶625 000；Western blotting結果證明制備的多克隆抗體對WP1具有很好的專一性。

小麥，種子過氧化物酶，WP1，表達純化，抗體制備

Abstract:Wheat peroxidases 1 (WP1) is the major cationic peroxidase of wheat (Triticum aestivum) grain, which is involved in the development of seeds and an important factor to affect the final processing quality of flour. We constructed a prokaryotic expression vector pET28a-WP1, and transformed it into E. coli host strain T7 Expression. His-tag fused WP1 existed as inclusion body, and the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography under denatured condition. The purity of target protein reached 98%. The recombinant WP1 was refolded by gradient urea dialysis, then used as antigen to immune rabbit to prepare polyclonal antibody. The result of ELISA showed that the titer of rabbit anti-WP1 antiserum was higher than 1:625 000. The result of Western blotting demonstrated that the prepared WP1 polyclonal antibody could be used to detect WP1 with high specificity.

Keywords:Triticum aestivum, grain peroxidase, WP1, expression and purification, antibody preparation

過氧化物酶同工酶廣泛存在于各種植物中，它們參與了植物體內許多重要的生理過程，如木質化和栓化、激素代謝、細胞壁蛋白質交聯(lián)、病原防御、耐鹽及抗氧化等[1]。植物過氧化物酶不僅在植物的生長發(fā)育和環(huán)境響應過程中發(fā)揮重要作用，而且作為重要的商品酶應用于生物催化、臨床檢測和生物技術研究等領域。如高分子材料的生產、有毒芳香化合物廢水的處理、基于ELISA的疾病診斷等[2-3]。

面粉是眾多食品加工的主要原料，如何改善面粉的加工性能是當前小麥育種和食品加工領域的研究熱點。育種研究者希望通過改變面粉中各種組分的含量改變面粉的加工性能，而食品加工研究者則希望通過在面粉中添加外源添加劑改變面粉的性質。已有研究結果顯示，面粉中谷蛋白和醇溶蛋白的組成和含量、過氧化物酶活性、脂過氧化物酶活性、二硫鍵異構酶活性、谷胱甘肽含量等均會不同程度影響面團的特性，添加化學氧化劑、添加外源過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶等均能改變面團的功能特征[4-6]。

1995年Converso等從小麥種子中純化到3種陽離子過氧化物酶組分，其中2種組分的理化性質和催化特性接近，而第3種與前兩者差異較大[7]；2001年 Caruso等從面粉中純化到一種陽離子過氧化物酶，將其命名為WP1，并證明其具有抗真菌活性[8]；2002年Yamashita等從面粉中純化到一種36 kDa陽離子過氧化物酶[9]，分析了其 N-末端序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在糖基化現(xiàn)象，糖基主要為甘露糖和巖藻糖。本研究組從面粉中純化到一種陽離子過氧化物酶(WP1)[10]，并克隆了該酶對應的基因，質譜分析結果顯示其與大麥種子過氧化物酶BP1高度同源，并對其理化性質進行了系統(tǒng)分析。結合前人和我們的實驗結果可知，小麥種子中存在非常強的過氧化物酶活力，WP1是小麥種子中最主要的陽離子過氧化物酶；應該參與種子的成熟過程，存在于面粉中的WP1應該對面團形成具有顯著影響，但是WP1參與種子的成熟和面團形成的機制目前尚不清楚。

本研究將小麥 WP1基因克隆到原核表達載體pET28a，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達并純化獲得重組WP1。使用重組蛋白免疫兔子，制備獲得小麥WP1多克隆抗體，并對多克隆抗體的效價和專一性進行了分析。為WP1的組織和細胞定位、在種子形成過程中的功能及其對面粉加工性能的影響等研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、2-log DNA ladder、蛋白 marker等為 NEB公司產品；Ni-NTA Superflow agarose純化介質為 Qiagen公司產品；PVDF (聚偏二氟乙烯膜) 轉印膜為 GE公司產品；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為Pierce公司產品；HRP標記的羊抗兔抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司；HRP-DAB顯色試劑盒購自北京Tiangen公司；其他常規(guī)試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌 DH5α和表達菌株 T7 Expression為NEB公司產品；pET28a表達載體為 Novagen公司產品；含有WP1基因cDNA的pPCR-WP1質粒為本實驗室保存。

1.1.3 實驗動物

2只新西蘭大耳白兔，體重約2 kg。

1.2 方法

1.2.1 表達載體構建

以含有WP1基因cDNA的質粒pPCR-WP1為模板，P1、P2為引物，通過PCR擴增獲得目的片段，回收的 PCR產物經EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連入pET28a表達載體，轉化大腸桿菌DH5α，獲得的重組質粒經雙酶切和PCR鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測序。所用引物序列如下：P1：5′-AT GGAATTC GCGGAGCCTCCGGTGGCGCGC-3′，P2:5′-ATGAAGCTT CTAGCCAAGCCTTTCTGCAGC-3′。

1.2.2 融合蛋白的表達

將表達載體 pET28a-WP1導入大腸桿菌 T7 Expression表達菌株，在含有50 μg/mL卡那霉素平板上篩選，挑取單菌落，在含有50 μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG (終濃度為0.5 mmol/L) 誘導。4 ℃、10 000×g 離心5 min收集菌體，5 mL菌液沉淀用 1 mL裂解緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑) 重懸，經超聲破碎，分別取裂解菌液及離心后上清液，利用15% SDS-PAGE進行分離檢測。

1.2.3 融合蛋白的親和純化

收集100 mL誘導表達后的菌體，加入10 mL裂解緩沖液重懸后超聲破碎，離心收集沉淀。用裂解緩沖液洗滌沉淀 3次去除可溶性蛋白，然后再用含0.1% Triton X-100的裂解緩沖液洗滌3次去除膜蛋白。用含有8 mol/L 尿素的裂解緩沖液溶解獲得的包涵體，4 ℃、10 000 × g離心20 min，將上清載入Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱，用5倍柱體積的漂洗緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 6.3) 洗柱以除去雜蛋白，最后用3倍柱體積的洗脫緩沖液 (100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 5.9) 洗脫目的蛋白。收集洗脫組分，利用 15%SDS-PAGE進行分離檢測。使用 Bio-Rad 公司的Quantity one軟件分析目的蛋白的相對量。

1.2.4 兔抗WP1血清的制備

依次用含 4、2、l、0.5、0.2 mol/L 尿素的 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液透析復性，然后與等體積弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合乳化后皮下多點注射，分4次進行免疫。首次按800 μg/只劑量免疫，皮下6點注射；第 21、35、49天分別按 400 μg/只劑量免疫，皮下4點注射。每次免疫10 d后，每只兔子耳緣靜脈取血0.5~1 mL，分離抗血清，間接ELISA檢測免疫后血清效價。第60天時采全血，分離抗血清，?20 ℃保存，ELISA檢測血清效價。

1.2.5 Western blotting檢測

取開花后15 d的小麥籽粒2 g，液氮中研磨后加入5 mL蛋白質提取液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，1% 2-巰基乙醇，1 mmol/L PMSF)，充分研磨勻漿，10 000×g離心15 min后取上清，加蛋白上樣緩沖液，利用 15% SDS-PAGE進行分離，再通過電轉印儀轉印至Hybond-P PVDF膜上。以方法1.2.4中制備的兔抗血清為一抗 (1∶50)，用辣根過氧化物酶標記(HRP) 的羊抗兔抗體為二抗 (1∶2 000)，進行Western blotting檢測。

2 結果與分析

2.1 pET28a-WP1表達載體的構建

以質粒pPCR-WP1為模板，通過PCR擴增WP1基因編碼區(qū) (不包含信號肽區(qū)，共996 bp)，將其重組入表達載體 pET28a。圖 1為重組質粒 PCR和EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定結果，第1和2泳道均出現(xiàn)約1 000 bp的預期片段。將酶切鑒定正確的質粒進行測序，序列正確的重組質粒命名為pET28a-WP1。

圖1 重組質粒pET28a-WP1的雙酶切和PCR鑒定Fig. 1 Identification of recombinant vector pET28a-WP1 by double digestion and PCR. M: DNA marker; 1: pET28a-WP1 digested with EcoRⅠ and Hind ; 2: Ⅲidentification of pET28a-WP1 by PCR.

2.2 WP1融合蛋白的表達與純化

將構建的表達載體 pET28a-WP1轉化大腸桿菌T7 Expression 菌株，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時加IPTG誘導，分別收集誘導2、4、6 h后樣品，使用15% SDS-PAGE分析表達量隨時間變化，結果如圖2A所示。與對照泳道相比，泳道2、3、4都出現(xiàn)與預期大小一致的37 kDa條帶，且其表達量隨誘導時間而增加；誘導 4 h后，WP1即達到最大表達量。可溶性分析結果顯示，重組蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。將包涵體溶解于8 mol/L尿素溶液中，通過Ni-NTA瓊脂糖親和柱分離，最終獲得用于抗體制備的重組WP1。泳道灰度掃描分析結果顯示，重組蛋白純度大于98%，如圖2B所示。

圖 2 WP1在大腸桿菌中不同時間的表達情況及其分離純化的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression of WP1 in different time and purification through Ni-NTA agarose affinity chromatography. (A) M: prestained protein marker; 1:un-induced control; 2?4: the expression of WP1 after 2, 4, 6 h induction respectively. (B) M: prestained protein marker; 1: total protein; 2: soluble protein after inducing; 3: the purified WP1.

2.3 間接ELISA法檢測抗血清效價

使用2 μg/mL的WP1抗原包被酶標板，5%脫脂奶粉封閉，將抗血清或免疫前血清按稀釋度1∶1 000、1∶5 000、1∶25 000、1∶125 000、1∶625 000稀釋后加入酶標板中孵育，洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔二抗，最后以四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 為底物進行顯色，用酶標儀測450 nm波長的光吸收值。每個稀釋度重復3次，測定結果如圖3所示，每一點的標準差用垂直短線表示。以OD陽/OD陰＞2.1為標準，制備的WP1兔抗血清效價在1∶625 000以上。

圖3 ELISA測定WP1兔抗血清效價Fig. 3 Titer of rabbit anti-WP1 antiserum was detected by ELISA.

2.4 Western blotting檢測

為了檢測制備的WP1抗血清的特異性，提取小麥籽粒中的可溶性蛋白，利用 15% SDS-PAGE分離，蛋白印跡后依次用WP1抗血清 (一抗) 和HRP山羊抗兔抗體 (二抗) 雜交，以二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)為底物進行顯色，結果如圖4所示。圖4A為蛋白電泳結果，圖4B為Western blotting結果。圖4A中，第1泳道為重組的WP1，第2、3泳道分別為從“陜225”和“鄭農 16”小麥種子中提取到的可溶性蛋白；圖4B中，每個泳道中均出現(xiàn)一條約37 kDa的特異條帶，說明WP1抗血清不僅能與重組WP1特異結合，而且可以很好地識別小麥籽粒中的WP1。已有研究顯示小麥種子中的可溶蛋白中包含多種過氧化物同工酶，而 WP1抗血清與種子總蛋白雜交時僅出現(xiàn)一條帶，證明其對 WP1具有良好的專一性。

圖4 Western blotting檢測抗血清的特異性Fig. 4 Western blotting analysis the specificity of antiserum.(A) SDS-PAGE analysis. (B) Western blotting analysis. M:prestained protein marker; 1: the purified WP1 protein; 2, 3: the total soluble protein from wheat grain of Shan 225 and Zheng Nong16.

3 討論

制備抗體首先需要獲得高純度的目的蛋白。本研究將小麥WP1基因通過EcoRⅠ和Hind Ⅲ切點整合入pET28a載體，然后導入大腸桿菌T7 Expression菌株誘導表達。目的蛋白融合有 His標簽，融合蛋白以包涵體形式存在。首先用裂解緩沖液反復洗滌除去可溶性蛋白，然后用含0.1% Triton X-100的裂解緩沖液洗滌去除膜蛋白，經過上述方法獲得包涵體純度可達95%以上。為了獲得純度更高的重組蛋白，研究中使用尿素溶液溶解包涵體，然后使用Ni-NTA瓊脂糖親和介質在變性條件下進一步純化，最后獲得純度高于98%的重組WP1。蛋白質是否變性是影響最終抗血清效價的重要因素。本研究制備的重組蛋白以變性形式溶解于8 mol/L尿素中，制備抗體時，首先將其逐級透析去除尿素，使目的蛋白最大程度復性，與佐劑等體積混合后免疫兔子，本研究獲得的抗血清效價高達1∶625 000。

抗體對抗原蛋白的專一性對抗體應用非常重要。植物過氧化物酶是一個超家族，一個物種中通常存在幾十種到上百種過氧化物酶同工酶，如擬南芥全基因組中共有73個過氧化物酶基因[11]，水稻中共有138個過氧化物酶基因[12]。確定WP1多克隆抗體是否只與WP1特異反應而不與其他過氧化物酶同工酶結合對WP1抗體的應用非常關鍵。本實驗中提取了小麥種子可溶性總蛋白，通過Western blotting檢測WP1多克隆抗體的專一性，結果只出現(xiàn)一條特異條帶，因而制備的WP1多克隆抗體具有非常好的特異性。這為利用該抗體進行WP1的組織和細胞定位、分析不同小麥品種中WP1含量和加工性能關系等研究奠定了基礎。

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Prokaryotic expression, purification and preparation of polyclonal antibody for wheat grain peroxidase WP1 gene

Liwei Shan1, Ruchun Tang1, Sanyang Liu1, Sanhong Fan1,2, and Aiguang Guo1,2

1 College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
2 Key Laboratory of Agricultural Molecular Biology in Shaanxi Province, Yangling 712100, China

Received: March 16, 2010; Accepted: May 20, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30300222).

Corresponding author: Sanhong Fan. Tel/Fax: +86-29-87092262; E-mail: sanhong.fan@gmail.com Aiguang Guo. Tel/Fax: +86-29-87092262; E-mail: guoaiguang@yahoo.com.cn

國家自然科學基金 (No. 30300222) 資助。

Received: April 12, 2010; Accepted: July 19, 2010

Supported by: Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2006BAD06A08).

Corresponding author: Baoan Cui. Tel/Fax: +86-371-63558878; E-mail: baoancui@henau.edu.cn

國家“十一五”科技支撐計劃 (No. 2006BAD06A08) 資助。