水產動物遺傳連鎖圖譜構建和QTL研究現狀

葉 華, 王志勇

（1. 湖南農業大學 動物科技學院, 湖南 長沙 410128; 2. 集美大學 水產學院 福建省高校水產科學技術與食品安全重點實驗室, 福建 廈門 361021）

水產動物遺傳連鎖圖譜構建和QTL研究現狀

Progress on genetic linkage maps and quantitative trait locations of aquatic animals

葉 華1,2, 王志勇2

（1. 湖南農業大學 動物科技學院, 湖南 長沙 410128; 2. 集美大學 水產學院 福建省高校水產科學技術與食品安全重點實驗室, 福建 廈門 361021）

水產養殖業是農業領域中發展較快的一個分支,然而隨著水產養殖業快速的發展, 許多養殖種類經過多年的人工繁殖和人工養殖帶來的負面效應也日趨顯現, 如性成熟過快、個體小型化、品質（肉質）下降、抗逆性下降, 病害日益頻繁等養殖性狀嚴重衰退的現象。這迫切需要對水產養殖動物進行選育和遺傳改良, 培育出優質高產抗逆的優良品種。傳統的選擇是在個體表型性狀及系譜信息基礎上借助適當的統計工具而進行的。然而與經濟價值相關的性狀多為數量性狀, 傳統的方法難以做到準確選擇, 因而進展往往較慢或不穩定, 有些性狀（如肉質）無法直接對入選個體進行測量, 無法進行直接選擇。未來的遺傳改良要更多地依賴于各種分子生物學手段, 如構建高密度的遺傳連鎖圖譜, 開發控制重要經濟性狀基因的標記, 開展標記輔助選育, 以提高育種效率。隨著分子標記技術發展和各國對水產動物基因組研究投入的增加, 構建遺傳連鎖圖譜的水產動物種類和圖譜密度在不斷增加, QTL （quantitative trait loci, 簡稱QTL）定位也相繼展開, 自1997至2006年,有近17種海淡水養殖動物的遺傳連鎖圖譜被公布[1],而至2010年, 則有近30種水產養殖動物的遺傳連鎖圖譜被公布。

1 遺傳連鎖圖譜的構建及研究現狀

1.1 遺傳連鎖圖譜的構建

遺傳連鎖圖譜（genetic linkage map）是指以遺傳距離表示基因組內基因以及專一的多態性DNA標記相對位置的圖譜, 它是對基因組進行系統性研究的基礎, 也是動植物遺傳育種的依據。遺傳連鎖圖譜構建過程包括: （1）選擇合適的作圖群體和合適的作圖標記。作圖群體包括 F1, F2, F3, F4, BC （Backcross）群體, 三交群體, 重組近交系（recombination inbred lines, 簡稱 RIL）和雙單倍體 （double haploid, 簡稱DH）。其中應用非常廣泛的是回交群體、DH群體和F2群體。作圖群體的選擇要根據作圖目標、不同物種創建作圖群體的難易程度及對圖譜分辨率的要求而定, 一般在構建高密度的遺傳連鎖圖譜時優先選擇 F2群體。遺傳標記經歷了形態標記、細胞學標記和生化標記之后, 發展到今天的分子標記階段。常用于作圖的分子標記主要有RFLP （restriction fragment length polymorphism, 簡稱 RFLP）、RAPD （random amplification polymorphism DNA, 簡稱 RAPD）、AFLP （amplified fragment length polymorphism, 簡稱AFLP）、SSR （simple sequence repeat, 簡稱 SSR）和SNP （single nucleotide polymorphism, 簡稱 SNP）等,應用最多的是AFLP標記和SSR標記。SSR標記因為含量豐富、多態性高、片段較小、在基因組中均勻分布以及呈共顯性遺傳等特性, 已經被廣泛運用于水產動物遺傳連鎖圖譜構建和QTL定位研究中。目前, 來自功能基因和EST （expressed sequence tags,簡稱 EST）中的 SSRⅠ型標記倍受研究者的青睞。SNP標記因為為雙等位型標記, 具有同一個位點多態性低而全基因組多態性又極其豐富的特點, 并且還具有遺傳穩定和分析簡單等優點, 是繼微衛星標記之后最為高效的標記, 將會被廣泛用于水產動物遺傳連鎖圖譜構建中; （2）分離標記的連鎖分析及圖譜的構建。通常各種DNA 標記基因型的表現形式是電泳帶型或峰型, 將帶型或峰型數字化是DNA標記分離數據進行數學處理的關鍵。兩點或多點測驗是遺傳連鎖圖譜構建的基本程序, 如果要對大量標記之間的連鎖關系進行統計分析, 就必須借助于計算機軟件。目前在水產生物連鎖圖譜構建中常用的作圖軟件有: CRIMAP、JOINMAP、MAPMAKER、MAPMANAGER、LINKMFEX等, 遺傳分析軟件的相關信息可通過數據庫 http://www.animalgenome.org/cgi-bin/util/sw_index獲得。

1.2 遺傳連鎖圖譜研究現狀

迄今, 農業經濟作物如水稻、玉米、高粱、大豆、番茄和豬、牛、雞等畜禽已經構建了比較完善的遺傳連鎖圖, 使一些有重要價值的基因得以定位和克隆, 使育種工作取得突破性進展[2]。

與在陸生動物及植物基因組圖譜方面已取得的成果相比, 對魚類的研究起步較晚, 直到 20世紀 80 年代初期才有人利用虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的雌核發育后代進行基因與著絲點間連鎖關系的研究[3]。作為脊椎動物發育模型的斑馬魚（Danio rerio）其遺傳連鎖圖譜構建工作開始于1994年, Postlethwait等[4]用RAPD標記和SSR標記構建了具29個連鎖群的斑馬魚的第一張遺傳圖譜。隨后多種分子標記如 SSCP（單鏈構象多態）、微衛星、STS、EST、SSLP等定位到斑馬魚遺傳連鎖圖譜上[5]。Shimoda等[6]將 2000個微衛星定位于斑馬魚的遺傳連鎖圖譜中, 使得斑馬魚遺傳連鎖圖譜的分辨率高達1.2厘摩, 大大提高了斑馬魚遺傳連鎖圖譜的飽和度。另外, 青

（Oryzias latipes）也被看作是一種很好的遺傳學研究模型, 青 遺傳連鎖圖譜的研究不如斑馬魚深入, 雖然發現多個與基因緊密連鎖的分子標記, 但是其圖譜飽和度較低[7]。

自1997年美國農業部啟動5種水產經濟動物基因組的研究工作以來, 挪威、丹麥、英國、日本、法國和加拿大等國家也陸續開展了水產動物的基因組研究。而基因組研究的基礎是遺傳連鎖圖譜的構建,到2009年, 在水產經濟動物中約有近30種海淡水養殖種類遺傳連鎖圖被公布（表 1）, 其中世界性的養殖種類如大西洋鮭魚（Salmo salar）、虹鱒、羅非魚（Oreochromis niloticus）、斑點叉尾（Ictalurus punctatus）等都已獲得高分辨率的圖譜, 足以進行經濟數量性狀定位, 重要功能基因的克隆和分子標記輔助選育也已相繼展開。

中國水產科學研究院于 1999年啟動了鯉（Cyprinus carpio）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和珠母貝（Pinctada martensii） 3種水產養殖動物的遺傳連鎖圖譜計劃。2000年, 中國黑龍江水產研究所的孫效文[25]利用黑龍江鯉（C. carpiso haematopterus）和柏氏鯉（C. pellegrini）的雜交F2構建遺傳連鎖圖譜。隨后, 大黃魚[27]、長牡蠣[38]、櫛孔扇貝[40]、海灣扇貝[41]、皺紋盤鮑[42]、白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[44]和中國明對蝦[45]等的遺傳連鎖圖譜也相繼發表。

2 QTL定位方法及研究現狀

2.1 QTL定位方法

水產動物多數重要經濟性狀為數量性狀, 目前,水產動物中常用的QTL定位分析軟件有MAPQTL、QTL MAPPER、WINDOWS QTL CARTOGRAPHER、QTL EXPRESS、MANAGER QTX等。QTL定位的方法有: 單標記作圖法、區間作圖法、復合區間作圖法和多區間作圖法。

單標記法每次定位只考慮一個標記座位, 根據分離群中標記基因型與數量性狀平均值的差異來確定該標記所在區域有無 QTL存在, 通常通過方差分析來檢驗標記基因型之間數量性狀平均值的差異顯著性。單標記分析法不能確切估算 QTL的位置, 具有檢測效率低和易出現假陽性等缺點。

區間作圖法（interval mapping, 簡稱 IM）是借助完整的分子標記連鎖圖譜, 以一元回歸模型和正態混合分布的極大似然函數為基礎, 計算基因組的各個位置上QTL存在和不存在的似然函數的比值的對數（LOD值）。該方法結果直觀, 能估算QTL的大致位置, 但當一個性狀在同一條染色體上存在多個QTL時, 其估計的位置和效應就會出現偏差, 產生“幻影”QTL。

復合區間作圖法（composite interval mapping, 簡稱 CIM）是在 IM 上發展而來, 它將多元回歸分析同極大似然法相結合, 在一個區間內分析 QTL時, 把檢測區間以外標記的效應值考慮到模型中以控制遺

傳背景效應。1998年Zhu等[46]提出了基于混合線性模型的復合區間作圖法, 可定位 QTL的上位性和基因型×環境的互作效應的QTL, 更加完善了復合區間作圖法。目前該方法被普遍認為是同時標定多個QTL更有效、更精確的方法。

表1 水產動物連鎖圖譜進展情況Tab. 1 Current status of linkage maps in aquaculture species

多區間作圖（multiple interval mapping, 簡稱MIM）是利用Cockerham模型將QTL作圖模型擴展到多重QTLs模型, 同時利用多個標記區間進行多個QTL作圖。該方法待估算的參數多, 計算量非常大。

2.2 QTL定位研究現狀

QTL 定位是以一定飽和度的遺傳連鎖圖譜為基礎, 通過連鎖分析確定數量性狀位點、即QTL 在圖譜上的位置與特定標記之間的遺傳距離。由于水產動物遺傳圖譜的分辨率低, 每個連鎖群上的標記較少, 水產動物 QTL研究不夠深入, 有關水產動物的QTL研究在羅非魚、虹鱒、叉尾、牙鲆和鯉魚等進行較多。在羅非魚上研究較多的性狀有生長速度、性別決定、低溫耐性以及抗病性等, 其中已成功將與抗寒性狀相關的 QTL位點定位到 23號連鎖群上[47]。也定位了11個與性別決定通路有關的基因標記, 并且Dax1同時進入兩個連鎖群 LG16和LG21[48]。在鮭科魚類上已定位了生長速度、病害及寄生蟲抗性、溫度上限、發育速度、雄性早熟、產卵日期以及其他有關選擇育種或者進化的一些性狀。在虹鱒魚上已經對耐高溫、產卵季節、胚胎發育速率等性狀進行了定位研究[49], 另外還分別找到兩個與傳染性胰腺壞死病（infectious pancreatic necrosis, 簡稱 IPN）抗性以及兩個與傳染性造血細胞壞死病（infectious hematopoietic necrosis, 簡稱IHN）抗性有關的 QTL[50]。Houston等[51]將多數與IPN相關的QTL定位到21號連鎖群上。在斑點叉尾上定位了與飼料轉化效率相關的 QTL, 還發現數個標記與抗腸道細菌病（enteric septicemia of catfish, 簡稱ESC）性狀相連鎖[52]。在牙鲆上找到一個與淋巴囊腫病抗性（lymphocystis disease, 簡稱LCD）相關的QTL, 利用該分子標記輔助, 選擇抗病基因純合體作為親本與不具有該抗病基因但生長迅速的商業品系雜交,培育出的后代對 LCD具有抗病力, 已經應用到商業化生產[53]。在鯉魚上, Sun等[25]將一個與抗寒性狀相連鎖的隨機擴增長度多態性標記（RAPD）定位到第 5號連鎖群上。

3 展望

目前, 水產養殖動物的遺傳連鎖圖譜分辨率還較低, 除鮭鱒等少數種外, 連鎖群上的標記數量還較少, 難以進行 QTL的精確定位。分子標記的快速發展將推動水產生物高密度遺傳連鎖圖譜的構建,在高密度遺傳連鎖圖譜基礎上進行的 QTL定位和MAS將在水產養殖動物遺傳改良中發揮重要的作用,也將推動水產養殖持續、快速和健康發展。

[1] 常玉梅, 孫效文. 水產養殖動物遺傳連鎖圖譜及QTL定位研究進展[J]. 動物學研究, 2006, 27（5）:533-540.

[2] 岳志芹, 孔杰, 戴繼勛. 水產動物遺傳連鎖圖譜的研究現狀及應用展望[J]. 遺傳, 2004, 26（1）: 97-102.

[3] Tompson D, Scott A P. An analysis recombination data in gynogenetic diploid rainbow trout[J]. Heredity, 1984,53: 441-452.

[4] Postlethwait J H, Johnson S L, Midson C N, et al. A genetic linkage map for the zebrafish[J]. Science, 1994,264: 699-703.

[5] Gates M A, Kim L, Egan E S, et al. A genetic linkage map for zebrafish: comparative analysis and localization of genes and expressed sequences[J]. Genome Res,1999, 9: 334-347.

[6] Shimoda N, Knapik E W, Ziniti J, et al. Zebrafish genetic map with 2000 microsatellite markers[J]. Genomics, 1999, 58: 219-232.

[7] Kimura T, Yoshida K, Shimada A, et al. Genetic linkage map of medaka with polymerase chain reaction length polymorphisms[J]. Gene, 2005, 363: 24-31.

[8] Nichols K M, Young W P, Danzmann R G, et al. A consolidated linkage map for rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）[J]. Anim Genet, 2003, 34: 102-115.

[9] Guyomard R, Mauger S, Kamila T C, et al. A type I and type II microsatellite linkage map of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss） with presumptive coverage of all chromosome arms[J]. BMC Genomics, 2006, 7:302-315.

[10] Danzmann R G, Cairney M, Davidson W S, et al. A comparative analysis of the rainbow trout genome with 2 other species of fish （Arctic charr and Atlantic salmon） within the tetraploid derivative salmonidae family （subfamily: Salmoninae）[J]. Genome, 2005,48:1 037-1 051.

[11] Moen T, Hoyheim B, Munck H, et al. A linkage map ofAtlantic salmon （Salmo salar） reveals an uncommonly large difference in recombination rate between the sexes[J]. Anim Genet, 2004, 35: 81-92.

[12] Gilbey J, Verspoor E, McLay A, et al. A microsatellite linkage map for Atlantic salmon （Salmo salar）[J]. Anim Genet, 2004, 35: 98-105.

[13] Gharbi K, Gautier A, Danzmann R G, et al. A linkage map for brown trout （Salmo trutta）: chromosome homeologies and comparative genome organization with other salmonid fish[J]. Genetics, 2006, 172: 2 405-2 419.

[14] Woram R A, Mcgowan C, Stout J A, et al. A genetic linkage map for Arctic char （Salvelinus alpinus）: evidence for higher recombination rates and segregation distortion in hybrid versus pure strain mapping parents[J]. Genome, 2004, 47: 304-315.

[15] Kocher T D, Lee W, Sobolewska H, et al. A genetic linkage map of a cichlid fish, the tilapia （Oreochromis niloticus）[J]. Genetics, 1998, 148: 1 225-1 232.

[16] Agresti J J, Seki S, Cnaaani A, et al. Breeding new strains of tilapia: development of an artificial center of origin and linkage map based on AFLP and microsatellite loci[J]. Aquaculture, 2000, 185: 43-56.

[17] Lee B Y, Lee W J, Streelman J T, et al. A second generation genetic linkage map of tilapia （Oreochromisspp.）[J]. Genetics, 2005, 170: 237-244.

[18] Waldbieser G C, Bosworth B G, Nonneman D J, et al. A microsatellite-based genetic linkage map for channel catfish,Ictalurus punctatus[J]. Genetics, 2001, 158:727-734.

[19] Kucuktas H, Wang S, Li P, et al. Construction of genetic linkage maps and comparative genome analysis of catfish using gene-associated markers[J]. Genetics,2009, DOI: 108.098855.

[20] Liu Z, Karsi A, Li P, et al. An AFLP-based genetic linkage map of channel catfish （Ictalurus punctatus）constructed by using an interspecific hybrid resource family[J]. Genetics, 2003, 165: 687-694.

[21] Poompuang S, Na-Nakorn U. A preliminary genetic map of walking catfish （Clarias macrocephalus）[J].Aquaculture, 2004, 232: 195-203.

[22] Coimbra M R, Kobayashi K, Koretsugu O, et al. A genetic linkage map of the Japanese flounder,Paralichtys olivaceus[J]. Aquaculture, 2003, 220: 203-218.

[23] Chistiakov D A, Hellemans B, Haley C S, et al. A microsatellite linkage map of the European sea bassDicentrarchus labraxL.[J]. Genetics, 2005, 170:1 821-1 826.

[24] Watanabe T, Fujita H, Yamasaki K, et al. Preliminary study on linkage mapping based on microsatellite DNA and AFLP markers using homozygous clonal fish in ayu（Plecoglossus altivelis）[J]. Mar Biotechnol, 2004, 61:327-334.

[25] Sun X W, Liang L Q. A genetic linkage map of common carp （Cyprinus carpioL.） and mapping of a locus associated with cold tolerance[J]. Aquaculture, 2004, 238:165-172.

[26] Ohara E, Nishimura T, Nagakura Y, et al. Genetic linkage maps of two yellowtails （Seriola quinqueradiataandSeriola lalandi）[J]. Aquaculture, 2005, 244: 41-48.

[27] Ning Y, Liu X D, Wang Z Y, et al. A genetic map of large yellow croakerPseudosciaena crocea[J].Aquaculture, 2007, 264（1）: 16-26.

[28] Sanetra M, and Meyer A. A microsatellite-based genetic linkage map of the cichlid fish,Astatotilapia burtoniand a comparison of genetic architectures among rapidly speciating cichlids[J]. Genetics, 2009, 182:387-397.

[29] Bouza C, Hermida M, Pardo B G, et al. A microsatellite genetic map of the turbot （Scophthalmus maximus）[J].Genetics, 2007, 177: 2 457-2 467.

[30] Wang C, Zhu Z, Lo L, et al. A microsatellite linkage map of barramundi,Lates calcarifer[J]. Genetics, 2007,175: 907-915.

[31] Wilson K, Li Y T, Whan V, et al. Genetic mapping of the black tiger shrimpPenaeus monodonwith amplified fragment length polymorphism[J]. Aquaculture, 2002,204: 297-309.

[32] Moore S S, Whan V, Davis G P, et al. The development and application of genetic markers for the kuruma prawnPenaeus japonicas[J]. Aquaculture, 1999, 173:19-32.

[33] Li Y, Byrne K, Miggiano E, et al. Genetic mapping of the kuruma prawnPenaeus japonicususing AFLP markers[J]. Aquaculture, 2003, 219: 143-156.

[34] Perez F, Erazo C, Zhinaula M, et al. A sex-specific linkage map of the white shrimpPenaeus（Litopenaeus）vannameibased on AFLP markers[J]. Aquaculture,2004, 242: 105-118.

[35] Li Z X, Li J, Wang Q Y, et al. AFLP-based genetic linkage map of marine shrimpPenaeus（Fenneropenaeus）chinensis[J]. Aquaculture, 2006, 261:463-472.

[36] Yu Z, Guo X. Genetic linkage map of the eastern oysterCrassostrea virginicaGmelin[J]. Biol Bull, 2003, 204:327-338.

[37] Hubert S, Hedgecock D. Linkage maps of microsatellite DNA markers for the Pacific oysterCrassostrea giga[J].Genetics, 2004, 168: 351-362.

[38] Li L, Guo X M. A primary linkage map for the Pacific oysterCrassostrea gigaswith AFLP markrs[J]. J Shellfish Res, 2002, 21（1）: 433.

[39] Li L, Xiang J H, Liu X, et al. Construction of AFLP-based genetic linkage map for zhikong scallop,Chlamys farreriJones et Preston and mapping of sex-linked markers[J]. Aquaculture, 2005, 245: 63-73.

[40] Wang L L, Song L S, Chang Y Q, et al. A preliminary genetic map of zhikong scallop （Chlamys farreriJones et Preston 1904）[J]. Aquaculture Res, 2005, 36:643-653.

[41] 李宏俊. 海灣扇貝微衛星標記的開發及遺傳連鎖圖譜的構建[D]. 北京: 中國科學院, 2009.

[42] Liu X D, Liu X, Guo X M, et al. A preliminary genetic linkage map of the pacific abaloneHaliotis discus hannaiIno[J]. Mar Biotechnol, 2006, 8: 386-397.

[43] Zhou Z C, Bao Z M, Dong Y, et al. AFLP linkage map of sea urchin constructed using an interspecific cross betweenStrongylocentrotus nudus（Venus） andS. intermedius（Mars）[J]. Aquaculture, 2006, 259: 56-65.

[44] 葛芹玉. 白鰱與團頭魴遺傳連鎖圖譜的構建[D]. 南京: 南京農業大學, 2002.

[45] 王偉繼, 孔杰, 董世瑞, 等. 中國明對蝦 AFLP分子標記遺傳連鎖圖譜的構建[J]. 動物學報, 2006, 52 （3）:575-584.

[46] Zhu J, Weir B S. Mixed model approaches for genetic analysis of quantitative traits [C]// Chen Lansun, Ruan S G, Zhu Jun . Advanced Topcis in Biomathematics proceedings of international conference on mathematical biology. Singapore: World Scientific Publishing Company, 1998: 321-330.

[47] Cnaani A, Hallerman M, Ron E M, et al. Detection of a chromosomal region with two quantitative trait loci,affecting cold tolerance and fish size, in an F2tilapia hybrid [J]. Aquaculture, 2003, 223: 117-128.

[48] Shirak A, Seroussi E, Cnaani A, et al.Amh and dmrta2 genes map to tilapia （Oreochromisspp.） linkage group 23 within QTL regions for sex determination[J]. Genetics, 2006, 174: 1 573-1 581.

[49] O’Malley K G, Sakamoto T, Danzmann R G, et al.Quantitative trait loci for spawning date and body weight in rainbow trout: testing for conserved effects acrsoo ancestrally duplicated chromosomes[J]. J Heredity, 2003, 94（4）: 273-284.

[50] Ozaki A, Sakamoto T, Khoo S, et al. Quantitative trait loci （QTLs） associated with resistance/susceptibility of infectious pancreatic necrosis （IPN） in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）[J]. Mol Genet Genomics, 2001,265: 23-31.

[51] Houston R D, Gheyas A, Hamilton A, et al. Detection and confirmation of a major QTL affecting resistance to infectious pancreatic necrosis （IPN） in Atlantic salmon（Salmo salar）[J]. Dev Biol （Basel）, 2008, 132: 199-204.

[52] 赫崇波, 周遵春, 劉衛東. 斑點叉尾的基因組研究[J]. 水產科學, 2005, 24 （1）: 38-40.

[53] Kanako F, Osamu H, Kazumitsu H, et al.Marker-assisted breeding of a lymphocystis disease-resistant Japanese flounder （Paralichthys olivaceus）[J]. Aquaculture, 2007, 272: 291-295.

（本文編輯: 譚雪靜）

Q75

A

1000-3096（2011）01-0105-06

2010-04-07;

2010-11-06

國家863計劃項目（2006AA10A405）; 國家自然科學基金（No:30771663）; 集美大學創新團隊科研基金（2006A001）資助

葉華（1981-）, 女, 四川廣元人, 博士研究生, 主要從事水產動物遺傳育種與生物技術研究, 電話: 0592-6183816, E-mail:yhlh2000@126.com; 王志勇, 通信作者, 教授, 博士生導師, E-mail:zywang@jmu.edu.cn