高古羅糖醛酸含量的萱藻（Scytosiphon lomentarius）多糖細微結構研究

吳建東, 于廣利, 王培培, 趙 峽, 楊 波, 臺文靜

（中國海洋大學 醫藥學院 糖科學與糖工程實驗室, 山東 青島 266003）

高古羅糖醛酸含量的萱藻（Scytosiphon lomentarius）多糖細微結構研究

吳建東, 于廣利, 王培培, 趙 峽, 楊 波, 臺文靜

（中國海洋大學 醫藥學院 糖科學與糖工程實驗室, 山東 青島 266003）

將青島產幼生和成熟期萱藻（Scytosiphon lomentarius）提取分離得到多糖, 經1H-NMR分析, 表明其為高古羅糖醛酸含量的褐藻膠, 在對其G/M值分析基礎上, 進一步對其二糖嵌段FMM, FMG, FGM, FGG和三糖嵌段FGGG, FGGM, FMGM, FMGG含量進行了比較分析。結果表明, 幼生和成熟期萱藻除了總糖含量不同外, 其褐藻膠細微結構也有顯著差別。幼生與成熟期萱藻中G/M分別為4.34和7.14, FGG含量分別為73%和84%, FGGG含量分別為68%和81%。成熟期萱藻中高含量多聚古羅糖醛酸是一種值得開發的多糖資源。

萱藻（Scytosiphon lomentarius）多糖; 聚古羅糖醛酸; 細微結構

褐藻膠（Alginate）是由甘露糖醛酸（Mannuronic acid, M）和古羅糖醛酸（Guluronic acid, G）組成的嵌段水溶性高分子, 主要來源于褐藻細胞壁, 由于其結構與藻種、產地以及生長季節有關, 使得褐藻膠細微結構差別很大。作為一種安全的生物功能高分子, 雖然褐藻膠在食品和化工中得到廣泛應用, 但作為藥物開發, 其細微結構研究十分重要[1-4], 為了獲得高含量甘露糖醛酸或者古羅糖醛酸的褐藻膠, 國內外一致從事褐藻新資源研究。

萱藻（Scytosiphon lomentarius）是我國沿海常見的藻種, 在山東半島和遼東半島廣泛分布, 產量較小。但國內外學者已經對其中的部分活性成分進行了研究, 如Demirel等[5]發現愛琴海產萱藻的二氯甲烷提取物有較強的抗氧化活性, 徐年軍等[6]發現萱藻的水提物能選擇性抑制 L1210活性, 徐秀麗等[7]發現萱藻的甲醇提取物對B 淋巴細胞增殖有較好的抑制活性和免疫抑制活性。在萱藻多糖研究方面, 劉志峰等[8]從萱藻中提取一種硫酸多糖, 發現其具有較好的抗凝血效果。關于萱藻中其他多糖的結構研究未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萱藻（Scytosiphon lomentarius）, 產地為青島, 分別于2008年2月和6月采于青島海邊, 藻種均經中國海洋大學海洋生命學院宮相忠副教授鑒定。

各種葡聚糖系列分子質量標準品（788, 404, 212,112, 47.3, 22.8和5.9 ku）購于日本Shodex公司; 乙醇、丙酮和鹽酸等常規試劑為國產分析純。

PL aquagel-OH mixed不銹鋼色譜柱（30 cm×7.5 mm×8 μm, 美國 Perkin Elmer公司）; 旋轉蒸發儀（R401型, 瑞典 BUCHI公司）; 高效液相色譜儀（LC-20AD, 日本島津公司）; 紅外光譜儀（Nicolet Nexus 470型, Thermo Electron公司）; 核磁共振波譜儀（JNM-ECP600, 日本理光）; 紫外可見分光光度計（UV-2102 PCS, 尤尼柯公司）; 冷凍干燥儀（EZ50, 美國FTS公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取[9]

萱藻經水洗、烘干、粉碎后用乙醇脫脂, 經碳酸鈉加熱提取后精制, 分別獲得幼生和成熟萱藻多糖。

1.2.2 分子量測定[10]

采用 HPGPC法測定多糖分子質量。使用 PL aquagel-OH mixed不銹鋼色譜柱; 流動相為0.2 moL/L NaNO3水溶液, 柱溫35℃, 流速0.5 mL/min,示差檢測器。將已知分子質量的葡聚糖系列標準品及多糖樣品用流動相配成5 g/L的溶液, 以標準多糖分子質量的對數（logMw）對保留時間（tR）作圖, 得標準曲線（logMw=14.8636?0.6837tR;R2=0.998）, 計算多糖相對分子質量。

1.2.3 紅外光譜（IR）分析[11]

樣品用P2O5干燥48 h, 取1～2 mg經KBr壓片,測定紅外光譜, 掃描范圍為400～4 000 cm–1。

1.2.4 1H-NMR分析

參照Grasdalen等[12-13]方法, 將樣品用稀鹽酸輕微解聚, 即0.1%水溶液, pH 3,于100 ℃水解1 h。將水解液中和, 旋轉濃縮, 40 ℃氮吹儀吹干, D2O交換3次, 在超導核磁共振波譜儀（ECP 600 MHz）于80 ℃測定。

2 結果與討論

2.1 多糖的提取

萱藻用水洗去鹽類、泥沙等雜質, 曬干后40 ℃烘干至恒重, 粉碎, 過40目篩。萱藻碎沫加入10 V 85%乙醇, 80 ℃水浴脫脂4 h, 重復操作3次, 離心,殘渣40 ℃烘干。脫脂海藻加入10 V蒸餾水, 80 ℃攪拌提取4 h, 離心, 重復操作3次。水提后的藻體殘渣, 40 ℃烘干后, 加入10 V的2 % Na2CO3溶液80 ℃提取4 h, 離心, 重復操作3次。合并濾液, 用4 mol/L鹽酸調節pH 8。旋轉蒸發濃縮, 加入95%乙醇使其終濃度達到30%, 4 ℃靜置過夜, 離心取沉淀。將沉淀溶解, 用 30%的乙醇重新醇沉, 沉淀依次用無水乙醇和丙酮脫水, 40 ℃烘干, 得幼生萱藻多糖（ISA）和成熟萱藻多糖（MSA）。

經HPGPC測定ISA和MSA得相對分子質量（Mr）分別為86 ku和50 ku。

2.2 萱藻褐藻膠細微結構研究

褐藻膠是由β-1,4-D-甘露糖醛酸（M）和α-1,4-L-古羅糖醛酸（G）組成, 分子中含有均聚M、均聚G以及雜聚MG 3種嵌段結構。甘露糖醛酸和古羅糖醛酸殘基是 C5差向異構體, 結構上只有羧基位置不同,但是它們的構型和化學性質有著非常大的差別。甘露糖醛酸是4C1構型并以平伏鍵連接; 而古羅糖醛酸是1C4構型以豎直鍵相連接。聚甘露糖醛酸結構具有柔性, 但聚古羅糖醛酸具有一定剛性, 這些結構特點使其在食品和醫藥等領域具有不同的作用。

經過IR（圖略）分析表明, 2種多糖是褐藻膠且古羅糖醛酸含量較高。采用1H-NMR（圖1）可以精確地表征褐藻膠中單糖組成及其雙聚（GG, GM, GM, MM）和三聚嵌段（GGG, GGM, MGM, MGG）含量, 從而反映出褐藻膠的嵌段細微結構, 為其構效關系研究提供理論依據。經過分析表明, 萱藻中褐藻膠主要是多聚古羅糖醛酸, 5.02 為異頭碳H1信號, 4.4 為均聚GG的H5信號峰; 當G兩邊均相鄰M時其化學位移為 4.73, 當 G兩邊分別相鄰 G和 M 時其化學位移為 4.75; 均聚 M 的異頭碳質子信號為4.62, 當M與G相連時其化學位移為4.65。

圖1 幼生與成熟萱藻褐藻膠1H-NMR圖譜Fig. 1 1H-NMR spectra of alginates from immature （A） and mature （B）Scytosiphon lomentarius

從圖 1可知, 幼生和成熟萱藻褐藻膠中古羅糖醛酸含量均非常高。結合1H-NMR數據并根據Grasdalen的計算公式, 可以得到單糖FM和FG, 二糖FMM、FMG、FGM和 FGG以及相鄰三糖 FMGM、FMGG、FGGM、FGGG嵌段的摩爾比例, 相關數據見表1。由表1可知,幼生和成熟期萱藻的FG含量均很高, 均大于0.8, 遠遠高于報道過的海帶和馬尾藻（FG=0.35～0.45）[14-15];成熟萱藻中 GG和 GGG的比例明顯大于幼生萱藻,而M含量明顯變小, 特別是GGM和MGG的比例較低, 說明均聚G段比例高而雜合M的比例小。由于兩種多糖中的均聚 G含量都很高, 和二價金屬離子結合能力強, 凝膠強度大, 該特點不僅適合于去除有毒金屬離子, 而且在含鈣食品中有特殊用途。高聚古羅糖醛酸含量多糖是一種性能優良的生物材料,將在食品、醫藥和印染行業中有很大的開發應用價值[14～17]。

表1 幼生和成熟期萱藻褐藻膠精細結構比較Tab. 1 Comparison of fine structures of alginates from immature and maturedScytosiphon lomentarius

2.3 褐藻膠嵌段分布研究[18-19]

由于褐藻膠是嵌段化合物, 所以多采用嵌段分布參數η來表征G和M的嵌段分布情況, 即η=FMG/（FM×FG）。η值的意義為 0≤η＜1, 表示M,G排列以均聚嵌段為主;η=1, 表示M,G排列為無規序列; 1＜η≤2,表示M,G排列為交替嵌段為主。通過比較η值的大小, 即可得到兩種萱藻褐藻膠中M, G的結構信息。由公式可得, ISA和MSA的η值分別為0.52和0.38。結果表明, 不同時期萱藻褐藻膠皆為均聚嵌段結構,成熟期均聚程度明顯高于幼稚期, 是一種理想的均聚古羅糖醛酸資源。

3 結論

以青島產兩種不同生長期的萱藻為材料并從中提取多糖, 通過1H-NMR方法確定其為褐藻膠, 并進一步測定了其單糖組成及其細微結構, 表明萱藻多糖是一種高古羅糖醛酸含量的褐藻膠, 而且隨著萱藻的成熟, G含量顯著增加并高達88%, 這是目前發現的天然海藻中聚古羅糖醛酸含量最高的藻種。該發現為以萱藻為原料直接提取高含量和高分子質量聚古羅糖醛酸提供了依據, 也為萱藻的大規模養殖, 以及對該藻種進行品種改良提供了重要參考。

[1] Grant G, Morris E, Rees D, et al. Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg box model [J]. FEBS Letters, 1973, 32（1）: 195-198.

[2] Grasdalen H, Larsen B, Smisrod O, et al. A PMR study of the composition and sequence of urinate residues in alginates [J]. Carbohydr Res, 1979, 68: 23-31.

[3] Haug A, Larsen B. Biosynthesis of alginate, Part II:polymannuronic acid 1,5-epimerase fromAzotobacter vinelandii[J]. Carbohydr Res, 1971, 17: 297-308.

[4] Salomonsen T, Jensen H, Larsen F, et al. Direct quantification of M/G ratio from 13C CP-MAS NMR spectra of alginate powders by multivariate curve resolution [J].Carbohydr Res, 2009, 15: 2 014-2 022.

[5] Demirel Z, Yilmaz-koz F, Karabay-yavasoglu U. Antimicrobial and antioxidant activity of brown algae from the Aegean Sea [J]. Journal of the Serbian Chemical Society, 2009, 74（6）: 619-628.

[6] 徐年軍, 范曉, 韓麗君, 等. 山東沿海海藻抗腫瘤活性的篩選[J]. 海洋與湖沼, 2001, 32（4）: 407-413.

[7] 徐秀麗, 范曉, 宋福行, 等. 中國經濟海藻提取物生物活性[J]. 海洋與湖沼, 2004, 35（1）: 55-63.

[8] 劉志峰, 宮曉黎, 魏淑貞, 等. 五種海藻多糖體外抗血小板聚集作用的觀察[J]. 中國海洋藥物, 2001, 2:36-38.

[9] 馬世昱, 劉崢, 王勤, 等. 羊棲菜中褐藻糖膠的組分分離及分析[J]. 工業微生物, 2002, 32（4）: 20-23.

[10] 王培培, 于廣利, 楊波, 等. 選育羊棲菜與野生羊棲菜中褐藻膠與褐藻糖膠組成分析[J]. 中國海洋藥物,2009, 28: 39-43.

[11] 嵇國利, 于廣利, 吳建東, 等. 爆發期條滸苔多糖的提取分離及其理化性質研究[J]. 中國海洋藥物, 2009,28: 7-12.

[12] Grasdalen H, Larsen B, Smisrod O.13C-n.m.r. studies of monomeric composition and sequence in alginate [J].Carbohydr Res, 1981, 2: 179-191.

[13] Grasdalen H. High-field,1H-n.m.r.spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformations[J].Carbohydr Res, 1983, 118: 244-260.

[14] 黃來發, 洪文生. 食品增稠劑[M]. 中國輕工業出版社, 2000: 25-26.

[15] 金駿, 林美嬌. 海藻利用與加工[M]. 北京: 科學出版社, 1993.

[16] 蔣新國, 海藻酸鈉的分子量與緩釋作用[J]. 藥學學報, 1994, 29（4）, 306-310.

[17] 朱思明, 于淑娟, 彭志英, 等. 海藻酸（鹽）的生產、應用及研究現狀[J]. 2003, 6: 61-65.

[18] 鄭乃余, 張燕霞. 海帶和馬尾藻中褐藻膠的糖醛酸組成與序列結構的研究[J]. 海洋與湖沼 1992, 23:445-453.

[19] Zheng naiyu, Zhang Yanxia, Fan Xiao, et al. Effects of composition and structure of alginates on adsorption of divalent metals [J]. Chin J Oceanol Limnol., 1994,12（1）: 78-83.

Received: Jan., 27, 2010

Key words:Scytosiphon lomentariuspolysaccharide; polyguluronic acid; fine structure

Abstract:The guluronic acid- rich alginate, extracted from immature and matureScytosiphon lomentarius,were studied by1H-NMR. Based on the G/M ratio analysis, the disaccharide fragments （FMM, FMG, FGM, and FGG） and trisaccharide fragments （FGGG,FGGM,FMGMand FMGG） were further analyzed with1H-NMR, respectively. The result shows that the total contents of guluronic acid and the fine structure of polysaccharides in immature and matureS.lomentariuswere different. The G/M ratio were 4.34 and 7.14, FGGratio 0.73 and 0.84, and the FGGGratio 0.68 and 0.81 in the immature and matureS. lomentarius, respectively. The matureS. lomentariusthat has a high content of polyguluronic acid is a good resource for polysaccharide extraction.

（本文編輯:康亦兼）

Fine structures of guluronic acid-rich aliginate from Scytosiphon lomentarius

WU Jian-dong, YU Guang-li, WANG Pei-pei, ZHAO Xia, YANG Bo, TAI Wen-jing

（School of medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003,China）

Q949.28+8.3; R282.77

A

1000-3096（2011）01-0040-04

2010-01-27;

2010-05-25

國際合作項目（2007DFA30980）; 國家自然基金項目（30870506）

吳建東（1985-）, 男, 山東文登人, 碩士研究生, 研究方向:海洋糖藥物; 于廣利, 通信作者, 電話: 0532-82031560; E-mail:glyu@ouc.edu.cn