大菱鲆親魚(yú)、配子和仔稚魚(yú)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

馬愛(ài)軍, 雷霽霖, 王新安, 黃智慧, 丁福紅

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚(yú)類(lèi)種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071）

大菱鲆親魚(yú)、配子和仔稚魚(yú)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

Quality assessment of broodstock, sperm, egg, oosperm and larva of turbot （Scophthalmus maximus L.）

馬愛(ài)軍, 雷霽霖, 王新安, 黃智慧, 丁福紅

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所 青島市海水魚(yú)類(lèi)種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071）

自 1992年大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）被引入中國(guó)以來(lái), 在海水魚(yú)類(lèi)工廠化養(yǎng)殖領(lǐng)域取得了重大成效[1]。近年來(lái), 引進(jìn)的大菱鲆在中國(guó)種質(zhì)退化現(xiàn)象較為嚴(yán)重[2]。調(diào)研表明, 在2000～2001年大菱鲆苗種經(jīng)10個(gè)月的養(yǎng)成有30%可達(dá)到上市規(guī)格, 現(xiàn)在養(yǎng)成10個(gè)月能達(dá)到上市規(guī)格的不到10%, 整批苗種達(dá)到上市規(guī)格要在18個(gè)月以上, 甚至2 a。為促進(jìn)中國(guó)大菱鲆健康、穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展, 科研人員對(duì)其進(jìn)行了一些列良種選育及繁育優(yōu)化研究。在此過(guò)程中,依據(jù)一定的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)選擇優(yōu)良的親魚(yú)、精子、卵子、受精卵和仔稚魚(yú)是極其重要的。多年來(lái), 盡管?chē)?guó)外對(duì)大菱鲆親魚(yú)、精子、卵子、受精卵和仔稚魚(yú)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法、尤其對(duì)精子和卵子的評(píng)價(jià)方法從不同的角度進(jìn)行了探討, 并根據(jù)所采用的指標(biāo)得出相應(yīng)的質(zhì)量評(píng)估參數(shù)。但目前尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)。作者分別詳細(xì)綜述了國(guó)內(nèi)外大菱鲆親魚(yú)、精子、卵子、受精卵和仔稚魚(yú)質(zhì)量評(píng)估方法及其相應(yīng)的評(píng)估參數(shù), 以期為在大菱鲆繁育（選育）過(guò)程中選擇質(zhì)量?jī)?yōu)良的親魚(yú)、精子、卵子、受精卵和仔稚魚(yú)提供參考依據(jù)。

1 親魚(yú)質(zhì)量評(píng)價(jià)

對(duì)親魚(yú)質(zhì)量評(píng)估的研究主要集中于雌魚(yú), 通常采用的直接指標(biāo)是雌性親魚(yú)的繁殖力和產(chǎn)卵量。Jones[3]估算, 每年大菱鲆雌性親魚(yú)的排卵量為3×105個(gè)/kg, 繁殖力（卵母細(xì)胞數(shù)）為 106個(gè)/kg。Howell等[4]在兩個(gè)連續(xù)繁育季節(jié)對(duì)5尾雌大菱鲆（3～5 kg）的產(chǎn)卵狀況進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)每年相對(duì)繁殖力范圍是285～463 g/kg, 在研究范圍內(nèi)繁殖力和體質(zhì)量不相關(guān)。根據(jù)Fauvel等[5]所報(bào)道的“大菱鲆人工繁育技術(shù)”中雌性親魚(yú)繁殖力的演變資料估算, 兩組大菱鲆雌魚(yú)在連續(xù) 4 a（1988～1991年）繁殖力平均值的范圍分別是 7.0×104～1.3×105和 5.9×104～1.3×105個(gè)/kg; 4 組大菱鲆雌魚(yú)在連續(xù) 3 a（1989～1991年）繁殖力平均值的范圍分別是 2.1×104～1.5×105、1.2×106～3.3×106、6.9×104～2.5×105和 9.5×104～1.7×105個(gè)/kg; 一組大菱鲆雌魚(yú)在連續(xù) 2 a（1990～1991年）繁殖力平均值的范圍是 1.1×105～2.1×105個(gè)/kg。Fauvel等[6]研究了通過(guò)控制過(guò)熟來(lái)提高親魚(yú)的繁殖能力。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為對(duì)不同組別雌魚(yú)進(jìn)行每周檢查 2次和每周檢查5次兩種處理。結(jié)果表明, 除了1個(gè)組具有極低的繁殖力（0.95×105個(gè)/kg）外, 其余各組繁殖力 基 本 都 相 似 （2.69×105、 3.10×105、 2.89×105、2.87×105、2.64×105個(gè)/kg）, 兩種處理的平均繁殖力分別為 2.89×105、2.33×105個(gè)/kg。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 每一種處理中, 兩種處理之間的平均繁殖力都沒(méi)有明顯的差異（P＞0.05）; 一個(gè)繁殖組每尾魚(yú)的產(chǎn)卵數(shù)量與另一個(gè)繁殖組每尾魚(yú)的繁殖數(shù)量不因處理方法的不同而不同（P＞0.05）。據(jù)此推測(cè), 卵子是否過(guò)熟, 對(duì)利用繁殖力和產(chǎn)卵量評(píng)估親魚(yú)質(zhì)量基本上沒(méi)有影響。Fauvel 等[5]研究表明, 雄性大菱鲆個(gè)體質(zhì)量只有達(dá)到0.6 kg以上時(shí), 按摩其腹部才能擠出精液。精液百分比含量隨個(gè)體體質(zhì)量的增加而提高。Deniel[7]報(bào)道, 雄性大菱鲆的性成熟系數(shù)值（gonadosomatic index, 簡(jiǎn)稱(chēng)GSI）很低, 最高比率只達(dá)到接近0.6%。與其他魚(yú)類(lèi)比較, 說(shuō)明這個(gè)比率很低。在大菱鲆精子發(fā)生過(guò)程中, 精巢發(fā)育很慢。有關(guān)大菱鲆親魚(yú)質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究, 雷霽霖等[8]認(rèn)為選擇優(yōu)質(zhì)親魚(yú)的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)為: （1）體質(zhì)量 2～6 kg, 雌魚(yú) 3 kg（3～6 齡）以上, 體長(zhǎng)40 cm 以上; 雄魚(yú) 2 kg（2～6 齡）以上, 體長(zhǎng) 30～35 cm;（2）體型完整無(wú)缺、無(wú)畸形、活動(dòng)力強(qiáng)、集群性好、攝食積極。雌、雄兩性親魚(yú)性成熟標(biāo)準(zhǔn)為雌魚(yú)通過(guò)卵巢在腹面突出的程度判斷成熟度。0階段: 不突出;1階段: 卵巢后小葉輕微突出; 2階段: 卵巢后小葉明顯突出, 而前小葉輕微突出; 3階段: 卵巢前后小葉都明顯突出。當(dāng)雌魚(yú)發(fā)育到第3個(gè)階段時(shí), 可用手輕擠卵巢, 可見(jiàn)有成熟卵流出。大菱鲆雄魚(yú)性腺不明顯,擠壓力度大于雌魚(yú), 可見(jiàn)有精液流出。

2 精子、卵子及受精卵的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1 精子的質(zhì)量評(píng)價(jià)

精子質(zhì)量評(píng)價(jià)包括常規(guī)的精液檢查方法和近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一些新技術(shù)檢測(cè)手段。常規(guī)檢查方法主要是指精液密度、活力、形態(tài)等方面的判斷, 能夠快速評(píng)價(jià)精子質(zhì)量; 新技術(shù)檢測(cè)手段主要是指計(jì)算機(jī)輔助精子分析（computer assisted sperm analysis,簡(jiǎn)稱(chēng) CASA）[9]、流式細(xì)胞技術(shù)分析[10]、精子染色的顯微鏡檢測(cè)[11]、單細(xì)胞凝膠電泳[12]和低滲腫脹[13]等方法, 新技術(shù)檢測(cè)方法的建立為快速、多指標(biāo)、客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)精子質(zhì)量提供了技術(shù)保證。其中, 精液濃度和精子活力是較為常用的兩個(gè)指標(biāo)。Suquet等[14]認(rèn)為精子濃度可利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法、精子比容值法、分光光度推定法進(jìn)行評(píng)估; 精子活力可在議定標(biāo)度上通過(guò)運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的百分比、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的持續(xù)期或這兩個(gè)參數(shù)共同評(píng)估。Suquet等[14]利用精液濃度和精子活力這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)大菱鲆精子質(zhì)量評(píng)估的可行性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 利用精子比容值法精子濃度不能被精確評(píng)估; 利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法可以得到精子濃度的精確值, 但這種計(jì)數(shù)耗時(shí)較長(zhǎng), 對(duì)一尾雄魚(yú)精子濃度的評(píng)估需要 2 h; 利用分光光度測(cè)定法在420 nm波長(zhǎng)可以精確評(píng)估精子的濃度。黏性狀態(tài)精液的濃度（54.6×109個(gè)/mL±5.4個(gè)/mL）高于液態(tài)精液的濃度（20.0×109個(gè)/mL±2.4個(gè)/mL）,大菱鲆精液的稀釋倍數(shù)可以影響精子的活力。在1 : 10、1 : 100、1 : 1000 3個(gè)稀釋梯度下, 以每30 s為時(shí)間間隔對(duì)大菱鲆精子的活力進(jìn)行評(píng)估（運(yùn)動(dòng)精子的議定標(biāo)度: 0表示 0%, 1表示 0～25%, 2表示25%～50%, 3表示 50%～75%, 4表示 75%～100%）, 發(fā)現(xiàn)增加稀釋可導(dǎo)致大菱鲆精子活力降低（運(yùn)動(dòng)精子的百分比減少及精子運(yùn)動(dòng)的持續(xù)期降低）。在自然產(chǎn)卵季節(jié), 對(duì)于初次采集的精液, 運(yùn)用上述方法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明每尾魚(yú)提取精液的均值為1.6 mL±0.2 mL, 濃度為 38.3×109個(gè)/mL±5.9 個(gè)/mL,精子運(yùn)動(dòng)持續(xù)期為 6.06 min±1.08 min, 精子比容值為 40.4%±5.8%。對(duì)大菱鲆精子活力評(píng)價(jià)時(shí), 運(yùn)動(dòng)精子的議定標(biāo)度也可參照文獻(xiàn)[15]。即:“0”表示無(wú)運(yùn)動(dòng)精子, “1”表示有 1%～5%的運(yùn)動(dòng)精子, “2”表示有5%～29%的運(yùn)動(dòng)精子, “3”表示有 30%～79%的運(yùn)動(dòng)精子, “4”表示有 79%～95%的運(yùn)動(dòng)精子, “5”表示有95%～100%的運(yùn)動(dòng)精子。Suquet等[16]根據(jù)已報(bào)道的研究成果詳述了大菱鲆精子的特征, 并與部分淡水及海水魚(yú)類(lèi)的精子特征進(jìn)行了比較。大菱鲆 GSI值是很低的, 僅為0.6%～0.8%。每尾魚(yú)每次提取精液的均值為 0.2～2.2 mL, 濃度為 0.7×109～11.0×109個(gè)/mL,每次提取得到的精子總量為 0.2×109～12.0×109個(gè)精子, 和大多數(shù)淡水魚(yú)相比, 大菱鲆精子運(yùn)動(dòng)的持續(xù)期較長(zhǎng)為 1～17 min。大菱鲆精子的正常形態(tài)被認(rèn)為是一種原始的類(lèi)型, 借助電子顯微鏡觀察, 發(fā)現(xiàn)大菱鲆精子與其他已報(bào)道的大多數(shù)真骨魚(yú)精子相類(lèi)似。精子總長(zhǎng)度大約為 45 μm, 精子頭部為圓形（最大直徑為1.7 μm）沒(méi)有頂體。細(xì)胞核的前、后部呈現(xiàn)凹陷, 中間室出現(xiàn)萎縮, 聚集呈環(huán)狀物的 10個(gè)線粒體經(jīng)常是可計(jì)數(shù)的。等離子膜圍繞著鞭毛的近端, 形成“紗罩”, 鞭毛呈現(xiàn)典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)。Suquet等[17]研究了光周期、擠魚(yú)的頻率以及雌魚(yú)的存在對(duì)大菱鲆精液產(chǎn)量的影響, 其相關(guān)數(shù)據(jù)可為大菱鲆精子質(zhì)量評(píng)估提供借鑒。研究結(jié)果表明改變光周期對(duì)精液產(chǎn)量沒(méi)有影響, 在試驗(yàn)期間每尾魚(yú)總精液產(chǎn)量均值為 4.9 mL±0.9 mL, 平均精液濃度為 29.4×109個(gè)/mL± 2.8×109個(gè)/mL。在第二次自然排卵結(jié)束, 盡量刺激精液產(chǎn)生或?qū)е箩尫诺土康木? 結(jié)果得到平均精子濃度和平均精子活力分別為 47.6個(gè)/mL±10.2×109個(gè)/mL 和 2 min36 s±0 min47 s, 擠魚(yú)的頻率對(duì)精液總量、平均精子活力沒(méi)有影響, 在自然產(chǎn)卵時(shí)期雌魚(yú)的存在可以提高精子的活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為從3 min27 s±0 min52 s提高到 6 min38 s±1 min28 s。Geffen等[18]認(rèn)為在對(duì)精子質(zhì)量的描述方面盡管精子濃度、精子運(yùn)動(dòng)、受精率之間的關(guān)系并不直觀, 但這些參數(shù)仍然是評(píng)估精子質(zhì)量最常使用的指標(biāo)。為了界定大菱鲆精子質(zhì)量, Geffen等[18]利用運(yùn)動(dòng)精子的百分比、精子運(yùn)動(dòng)的保持力、溫度對(duì)精子運(yùn)動(dòng)保持力的影響、三磷酸腺甙（adenosine triphosphate, 簡(jiǎn)稱(chēng)ATP）濃度對(duì)精子運(yùn)動(dòng)保持力的影響等 4個(gè)參數(shù)對(duì)其進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 來(lái)源于不同雄魚(yú)的精子被激活初期, 運(yùn)動(dòng)精子的百分比是34.8%～97.6%, 均值為76.3%, 精子激活1 h后, 均值降低為48.1%, 同時(shí)保持運(yùn)動(dòng)的精子是激活初期運(yùn)動(dòng)精子的 27%～90%, 均值為 62.6%; 在?27℃下冷休克對(duì)激活初期精子的運(yùn)動(dòng)影響不大, 但激活 30 min后影響顯著（P＜0.05）,冷凍樣品保持運(yùn)動(dòng)的精子僅是激活初期運(yùn)動(dòng)精子的8.6%（范圍: 0～25%）, 而對(duì)照組保持運(yùn)動(dòng)的精子是激活初期運(yùn)動(dòng)精子的49%（范圍: 38%～63%）, 冷凍樣品和對(duì)照組之間差異極其顯著（P＜0.001）; 大菱鲆精子的ATP濃度變化范圍是（0.02～1.35） mg /106精子（均值: 0.46 mg /106精子, 相當(dāng)于9.2 nmol/108精子）, 激活后運(yùn)動(dòng)精子的百分比以及精子激活后運(yùn)動(dòng)的保持力和來(lái)至非激活精子的 ATP數(shù)量之間的相關(guān)性不顯著（P＞0.05）, 根據(jù) ATP濃度的 3個(gè)水平（1=高≥ 1.0 mg /106精子, 2=中=（0.9～0.1） mg /106精子, 3=低≤0.1 mg/106精子）將來(lái)自不同雄魚(yú)的精子分級(jí), 可發(fā)現(xiàn)一定的變化趨勢(shì), 在精子激活后的任何時(shí)刻, 高 ATP水平的運(yùn)動(dòng)精子的百分比顯著性地減少, 然而, 運(yùn)動(dòng)下降的比率可能和ATP水平有關(guān), 因?yàn)锳TP越低水平運(yùn)動(dòng)減少地越快。魚(yú)類(lèi)精子被激活后對(duì)其進(jìn)行生化變化的密切調(diào)查是非常有意義的一項(xiàng)工作。Suquet等[14]指出大菱鲆精子運(yùn)動(dòng)的持續(xù)期可能僅有5 min。Barton[19]報(bào)道大菱鲆精子在激活后 3, 15和28 min, 受精能力分別為97%、94%和22%。盡管以運(yùn)動(dòng)精子的百分比和精子運(yùn)動(dòng)的持續(xù)期為指標(biāo)對(duì)大菱鲆精子質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)估[18], 然而 Chauvaud 等[20]認(rèn)為由于技術(shù)粗糙, 這兩個(gè)參數(shù)不可能精確反映精子運(yùn)動(dòng)特征。精子運(yùn)動(dòng)是評(píng)估精子質(zhì)量最常用的參數(shù), 因?yàn)榫颖仨毘浞诌\(yùn)動(dòng)才能獲得突破卵子的能力。Chauvaud等[20]采用暗視野顯微觀察和頻閃照明-顯像記錄的方法對(duì)大菱鲆精子進(jìn)行觀察, 并對(duì)更能體現(xiàn)精子游泳行為的良好參數(shù)如鞭毛波動(dòng)頻率、游泳速度和精子運(yùn)動(dòng)距離進(jìn)行了測(cè)量。結(jié)果表明, 大多數(shù)新采集的精子在激活初期運(yùn)動(dòng)精子的百分比為100%, 在激活70～100 s后運(yùn)動(dòng)精子的百分比突然下降到 15%～30%; 精子激活后的前 40s鞭毛波動(dòng)頻率保持50 Hz常數(shù)值, 隨后突然下降到15～30 Hz; 激活后30～40 s期間精子運(yùn)動(dòng)速度約為200 μm/s, 激活50 s后下降到100 mm/s的穩(wěn)定值; 精子激活1.2 min后越來(lái)越多的精子停止運(yùn)動(dòng); 精子在激活后的1.2 min期間精子運(yùn)動(dòng)最小距離的平均值約為 12 mm。根據(jù)上述大菱鲆精子的運(yùn)動(dòng)特征可將精子運(yùn)動(dòng)分為 4個(gè)連續(xù)階段: 階段1, 持續(xù)40 s, 運(yùn)動(dòng)精子的百分比較高,鞭毛波動(dòng)頻率接近50 Hz; 階段 2, 在精子激活后第40秒, 運(yùn)動(dòng)精子的百分比突然下降到 30%, 鞭毛波動(dòng)頻率降為15～30 Hz直到運(yùn)動(dòng)結(jié)束; 階段3, 鞭毛末梢變的僵硬; 階段4, 從激活后80 s開(kāi)始, 越來(lái)越多的精子停止運(yùn)動(dòng), 整個(gè)鞭毛完全變的僵化。與其他魚(yú)類(lèi)比較, 大菱鲆精子的運(yùn)動(dòng)能力是很高的, 這在一定程度上能夠?qū)Υ罅怫倚埕~(yú)低GSI值（0.6%）[7]、小的精子釋放體積（最小值～最大值: 0.2 ～2.2 mL）、低精子濃度（0.7×109～11.0×109個(gè)/mL）和低精子產(chǎn)量（0.2×109～12.0×109個(gè)精子）[18]起到補(bǔ)償作用。Dreanno等[21]研究了尿液對(duì)大菱鲆精子質(zhì)量的影響。發(fā)現(xiàn)精子被尿液人工污染后延遲了精子運(yùn)動(dòng)的初始時(shí)間。利用 CASA技術(shù)對(duì)尿液污染精子的運(yùn)動(dòng)速度和對(duì)照組精子運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行測(cè)定, 發(fā)現(xiàn)在 30%被尿液污染的精液中, 精子初始運(yùn)動(dòng) 10 s后, 運(yùn)動(dòng)速度從 230 μm/s顯著地減小到160 μm /s（P＜0.05）。在精液中添加10%的尿液并混合15 min, 精子初始運(yùn)動(dòng)10 s后的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞百分比從83.4%顯著地減小到54.2%。此外, 尿污染對(duì)運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響隨尿液與精液的混合時(shí)間而顯著發(fā)生變化。尿污染后精子的受精率也顯著降低。

2.2 卵子和受精卵的質(zhì)量評(píng)價(jià)

從形態(tài)上觀察, 大菱鲆卵子呈球狀, 卵徑為0.91～1.20 mm, 卵內(nèi)僅含有一粒油球, 油球徑為0.15 ～0.22 mm[7]。雷霽霖等[23]也對(duì)大菱鲆卵子形態(tài)進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)大菱鲆卵呈圓球形, 無(wú)色透明, 中央有油球1個(gè), 亦無(wú)色透明, 平均卵徑為 0.98 mm, 平均油球徑為0.13 mm。Howell等[4]報(bào)道, 大菱鲆卵徑范圍是0.97～1.10 mm, 在每一繁殖季節(jié)期間卵徑存在下降趨勢(shì)。評(píng)價(jià)魚(yú)卵的質(zhì)量, 傳統(tǒng)的方法是計(jì)算受精率和孵化率。Sahin[24]在實(shí)驗(yàn)室條件下, 對(duì)黑海大菱鲆（Psetta maxima）的繁育性能進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在水溫15 ℃條件下, 大菱鲆卵的受精率很低, 僅為 27.6%, 孵化率為74.5%。Fauvel等[5]研究發(fā)現(xiàn), 在產(chǎn)卵受精協(xié)調(diào)一致的情況下大菱鲆卵的平均成活率為 85%, 受精率（受精卵/活卵）大約為68%。然而, 評(píng)價(jià)成活率存在著主觀性。對(duì)于大菱鲆而言, 卵巢以及卵子的pH存在不穩(wěn)定性, 當(dāng)排卵的時(shí)候pH變化較大。當(dāng)產(chǎn)卵時(shí)卵巢的pH為8.2時(shí), 卵的成活率為100%。當(dāng)pH為7.3時(shí)成活率則為 0。卵巢液具有較強(qiáng)的阻斷海水能力,使之形成一個(gè)受精的微環(huán)境, 其中包括pH對(duì)精子的受精能力和對(duì)卵子受精率的影響。卵巢pH的不穩(wěn)定可以作為一種目標(biāo)參數(shù), 成為搜集部分過(guò)成熟卵子狀態(tài)的特征而預(yù)告受精成功的可靠因素[5]。Devauchelle等[25]每周按摩1次雌魚(yú)腹部采集到卵子的平均受精率為 20%, 而Howell等[4]每天按摩1次雌魚(yú)腹部采集到卵子的平均受精率為24%。顯然, 從總體上看, 不同采集頻率對(duì)卵的受精率影響不大。對(duì)于大菱鲆卵子的質(zhì)量評(píng)價(jià), Fores等[22]在對(duì)卵子質(zhì)量研究的基礎(chǔ)上, 結(jié)合其他學(xué)者的觀點(diǎn)制定了大菱鲆卵子質(zhì)量的鑒定標(biāo)準(zhǔn)（表 1）。對(duì)于獲得的批量卵子,根據(jù)以下指標(biāo)進(jìn)行選擇孵化: 選擇在階段1和階段2中, 多于 50 mL的上浮卵[16], 顯示了高或中等程度的上浮, 卵徑＜1.1 mm。受精后受精率大于70%, 初次分裂的分裂球較大且對(duì)稱(chēng)率大于50%。Fores等[22]認(rèn)為卵徑是決定卵子活力的一個(gè)重要指標(biāo)。當(dāng)卵徑為 0.9～1.1 mm時(shí), 能夠產(chǎn)生比較高的受精率; 卵徑為1.1～1.2 mm時(shí), 可產(chǎn)生中等或比較低的受精率。這一結(jié)果與在其他魚(yú)類(lèi)中比較大的卵徑產(chǎn)生較高比率的受精率和孵化率不同。Fauvel等[6]在研究通過(guò)控制過(guò)熟來(lái)提高親魚(yú)的繁殖能力中發(fā)現(xiàn), 大菱鲆卵子的活力與孵化率是正相關(guān)的（r=0.63;P＜0.001）, 因此認(rèn)為卵子質(zhì)量的評(píng)估可由卵子的活力率（活的卵子數(shù)/總卵子數(shù)）來(lái)表示。對(duì)不同組別雌魚(yú)進(jìn)行每周檢查2次和每周檢查5次兩種處理, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 每天擠卵產(chǎn)生的均活力率（72.56%）顯著高于每周檢查 2次的均活力率（46.62%）（P＜0.01）。據(jù)此推測(cè)大菱鲆卵子過(guò)熟是導(dǎo)致卵子低活力并最終導(dǎo)致限制仔魚(yú)產(chǎn)量的主要原因, 因此應(yīng)用卵子活力率評(píng)估卵子質(zhì)量。為防止卵子過(guò)熟, 采卵應(yīng)在規(guī)范的程序下進(jìn)行。在對(duì)4組雌魚(yú)進(jìn)行每天采卵處理并研究其活力發(fā)現(xiàn), 各組活力率均值分別為59.59%、71.17%、74.42%、83.31%。顯然, 非過(guò)熟卵子活力間差異顯著（P＜0.05）。每周檢查 5次處理組的平均孵化率（34.45%）顯著高于每周檢查2次處理組的平均孵化率（11.47%）, 每周檢查2次2組的孵化率為9.88%、16.78%, 而每周檢查5次4組的孵化率分別為 30.02%、31.12%、32.57%、50.46%。Fauvel等[6]研究還發(fā)現(xiàn), 卵子發(fā)展到過(guò)熟階段, 活卵子到達(dá)仔魚(yú)階段的比例減少。這與 Howell等[4]的研究結(jié)果相一致, 他們認(rèn)為當(dāng)活力率在 40%左右時(shí), 僅有60%的活卵子被受精。由于了解了這種相關(guān)性, 認(rèn)為可以通過(guò)觀察受精前卵子的形態(tài)特征來(lái)預(yù)測(cè)卵子發(fā)育的潛在可能性,因此限定用孵化單位來(lái)預(yù)測(cè)卵子的質(zhì)量。Omnes等[26]認(rèn)為一個(gè)好的實(shí)用的卵質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是簡(jiǎn)單的。他們利用觀察卵形態(tài)特征和染色檢測(cè)技術(shù)對(duì)大菱鲆卵質(zhì)量評(píng)估方法進(jìn)行研究, 中性紅（neutral red）（可發(fā)育細(xì)胞被染成紅色, 非發(fā)育細(xì)胞不能被染成紅色）和臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue）（染料不能滲透可發(fā)育細(xì)胞, 死細(xì)胞則被染色）兩種染料被使用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大菱鲆卵的發(fā)育能力率（卵的成活率）約為 70%～85%。作者認(rèn)為利用中性紅和臺(tái)盼藍(lán)染料可更好地評(píng)估大菱鲆可發(fā)育卵或死卵的比例。Omnes 等[26]認(rèn)為沒(méi)有任何 100%可靠的方法去預(yù)測(cè)仔魚(yú)的飼養(yǎng)潛能。細(xì)胞的完整性并非卵質(zhì)量評(píng)估的唯一參數(shù), 生化標(biāo)準(zhǔn)和胚胎發(fā)育的環(huán)境條件也應(yīng)該被考慮。Kj?rsvik等[27]從卵子的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)、受精率和孵化率 3個(gè)方面對(duì)大菱鲆卵子質(zhì)量進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)良的卵子具有以下特征:（1）形態(tài)標(biāo)準(zhǔn): 在 8～32細(xì)胞期, 標(biāo)準(zhǔn)分裂球百分率為87%～94%; （2）受精率: 以過(guò)原腸期計(jì)數(shù), 卵的受精率為90%～95%; （3）孵化率: 孵化率為73%～82%。由于卵子的受精率和分裂球的形態(tài)決定著卵子、仔魚(yú)、稚魚(yú)的存活能力, 因此這 2個(gè)指標(biāo)可以提前預(yù)測(cè)仔魚(yú)的質(zhì)量。由于操作簡(jiǎn)單, 卵子的受精率和分裂球的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)通常被應(yīng)用到海水魚(yú)類(lèi)卵子質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)中。對(duì)于上述3個(gè)標(biāo)準(zhǔn), 由于卵裂早期觀察的卵質(zhì)量與其孵化率以及由這些卵孵化出幼體的存活率之間存在顯著的正相關(guān)[28], Kj?rsvik等[29]建議把卵裂早期卵的對(duì)稱(chēng)性（形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)）作為評(píng)價(jià)海水魚(yú)卵質(zhì)量的主要指標(biāo)。這一形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)至今仍最具可信性。受精卵的高孵化率和仔魚(yú)的高成活率說(shuō)明來(lái)源于親魚(yú)的卵的質(zhì)量是優(yōu)良的[23]。Bromage等[30]提出 3個(gè)影響卵質(zhì)量的重要因素是卵表面的菌群、親魚(yú)營(yíng)養(yǎng)、卵子的過(guò)熟。大菱鲆受精卵呈圓球形, 無(wú)色透明, 屬端黃卵, 呈盤(pán)狀分裂, 分裂方式與其他硬骨魚(yú)類(lèi)相似。孵化前不久, 胚胎體軀干部色素增多, 尤以背鰭前端和尾部的上、下鰭膜出現(xiàn)的兩叢棕黃色素叢為其標(biāo)志, 據(jù)此可以判斷卵質(zhì)和胚胎發(fā)育的優(yōu)劣[23]。Sahin[24]對(duì)黑海大菱鲆受精卵研究發(fā)現(xiàn), 受精卵呈球型、懸浮、內(nèi)含一油球, 受精卵卵徑為 1.213 mm±0.063 mm。雷霽霖等[8]認(rèn)為優(yōu)良受精卵的典型特征為透明、渾圓, 卵周隙小。受精后的第1、2次分裂,清晰對(duì)稱(chēng), 說(shuō)明此批卵受精率和孵化率高。

表1 大菱鲆卵子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[22]Tab. 1 Quality criteria of turbot egg （Scophthalmus maximusL.）[22]

3 仔稚魚(yú)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.1 仔稚魚(yú)質(zhì)量評(píng)估的發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)

Sahin[24]對(duì)黑海大菱鲆研究發(fā)現(xiàn), 初孵仔魚(yú)全長(zhǎng)2.63～3.33 mm, 均值為 3.12 mm±0.140 mm。卵黃囊均值大小926 μm, 油球直徑243 μm。到初次開(kāi)口攝食, 全長(zhǎng)均值增長(zhǎng)到3.44 mm±0.262 mm。仔魚(yú)的成活率是對(duì)仔魚(yú)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估的最直接標(biāo)準(zhǔn)。Fauvel等[5]對(duì)來(lái)源于 3個(gè)池塘的親魚(yú)種群后代的成活率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 3個(gè)池塘連續(xù) 3 a（1989～1991年）的成活率依次分別為79%、71.5%、81%, 87%、69.5%、80%, 73.5%、沒(méi)有估算、72.5%。Sahin[24]對(duì)黑海大菱鲆仔魚(yú)存活率研究發(fā)現(xiàn), 孵化后 5日齡仔魚(yú)的存活率是 64.52%, 15日齡的存活率是 12.47%,25日齡的存活率是5.48%, 此后, 存活率幾乎變化不大。在整個(gè)仔魚(yú)期, 即 0～60日齡, 存活率大約為5.2%。大菱鲆早期仔稚魚(yú)存活率存在很大差異,Robin[31]報(bào)道 27日齡仔魚(yú)存活率是 7.5%～8.3%～20.2%（使用 3種不同的富集材料）; Estévez等[32]在45日齡獲得了30%的平均存活率; Olsen等[33]聲稱(chēng)對(duì)于鲆鰈魚(yú)類(lèi)到變態(tài)和餌料轉(zhuǎn)換后（即 80日齡）總體存活率范圍通常是 0～10%; 根據(jù) Witt等[34]報(bào)道, 從孵化到餌料轉(zhuǎn)換, 理想的平均存活率范圍是5%～10%。上述 Sahin[24]研究表明, 0～60日齡, 大菱鲆存活率為5.2%, 顯然存活率在正常范圍內(nèi)。雷霽霖等[23]對(duì)大菱鲆仔稚幼魚(yú)發(fā)育進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 胚后仔魚(yú)階段, 體背部色素逐步增深, 魚(yú)體逐漸由透明變?yōu)椴煌该? 由兩側(cè)對(duì)稱(chēng)變?yōu)椴粚?duì)稱(chēng)。3日齡仔魚(yú)開(kāi)口;1～9日齡仔魚(yú), 體色呈紅色, 稱(chēng)之為“紅苗”; 10～24日齡, 黑色素增多, 稱(chēng)之為“黑苗”; 25日齡以上, 體披大量花狀色素, 稱(chēng)之為“花苗”, 由此魚(yú)體變寬, 右眼開(kāi)始上升; 30日齡苗, 右眼已上移至頭頂背部;35～38日齡苗, 右眼已完全轉(zhuǎn)移至左側(cè), 變態(tài)完成而具鲆鰈類(lèi)所特有的形態(tài)、生態(tài)和生理狀態(tài)。

3.2 仔稚魚(yú)質(zhì)量評(píng)估的生化標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于海水魚(yú)類(lèi)仔魚(yú)的質(zhì)量評(píng)估, 基于生化標(biāo)準(zhǔn)的方法被認(rèn)為是更有效和更敏感的, 因?yàn)閿z食體制的變化首先反映在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平, 然后才體現(xiàn)在整個(gè)有機(jī)體[35]。仔魚(yú)的RNA、DNA和蛋白質(zhì)含量是經(jīng)常被利用的生化標(biāo)準(zhǔn)[36-41]。Cunha等[42]利用兩種生物多元統(tǒng)計(jì)分析的方法（主成分分析-PCA和逐步判別分析-SDA）, 以核苷酸（DNA 和 RNA）和蛋白質(zhì)含量為指標(biāo), 評(píng)估了大菱鲆仔稚魚(yú)（發(fā)育時(shí)期小于12～13 d, 苗干質(zhì)量低于200 μg）的營(yíng)養(yǎng)狀況。結(jié)果表明, 來(lái)源于 2種處理的生化資料經(jīng)多元分析將具有特定結(jié)構(gòu)的試驗(yàn)材料可以分為幾個(gè)組。通過(guò)甄別每一批試驗(yàn)材料中仔魚(yú)的發(fā)育期和營(yíng)養(yǎng)狀況, 并將這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和生化分析（RNA、DNA和蛋白質(zhì)含量）相關(guān)聯(lián)確定了4個(gè)組, 即G1、G2、G3、G4, 分別代表營(yíng)養(yǎng)狀況次理想、最理想、極其缺乏和缺乏 4種情況。經(jīng)逐步判別分析（stepwise discriminant analysis,簡(jiǎn)稱(chēng) SDA）, 4個(gè)組的判別函數(shù)式分別為 G1:Y=?20.5+183.9X1+0.3X2?2.3X3; G2:Y=?52.8+274.6X1+0.3X2?3.2X3; G3:Y= ?84.8+345.6X1?27.5X2?2.2X3; G4:Y= ?30.7+224.6X1?8.1X2-2.3X3。式中,X1、X2、X3分別表示DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育背景不清晰的仔魚(yú)個(gè)體或仔魚(yú)新樣本, 要判斷所歸屬的組別, 只需將仔稚魚(yú)個(gè)體或仔稚魚(yú)新樣本的DNA、RNA和蛋白質(zhì)含量指標(biāo), 分別代入上述4組的判別公式, 計(jì)算出4個(gè)函數(shù)值, 以函數(shù)值最大的判別函數(shù)所對(duì)應(yīng)的組作為所屬組別。

3.3 仔稚魚(yú)質(zhì)量評(píng)估的細(xì)菌環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)

Gatesoupe[43]認(rèn)為對(duì)魚(yú)類(lèi)仔稚魚(yú)的質(zhì)量評(píng)價(jià)除了發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)和生化標(biāo)準(zhǔn)外, 還應(yīng)該考慮細(xì)菌環(huán)境的影響。他利用7批孵化后1～10 d大菱鲆仔稚魚(yú), 通過(guò)對(duì)10日齡稚魚(yú)魚(yú)的成活率和平均體質(zhì)量、8日齡稚魚(yú)分別在Petrifilm干膜和TCBS瓊脂上的細(xì)菌數(shù)以及9日齡稚魚(yú)分別在弧菌NP、弧菌P、無(wú)弧菌感染3種條件下48 h內(nèi)成活率的統(tǒng)計(jì)對(duì)大菱鲆仔魚(yú)質(zhì)量的早期評(píng)估方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明, 10日齡稚魚(yú)的平均成活率為 66%, 其中第 2批稚魚(yú)的成活率最低,僅為30%, 第5批稚魚(yú)的成活率最高, 為95%; 10日齡稚魚(yú)的總體平均體質(zhì)量為0.57 mg, 其中第2批均質(zhì)量最低為0.37 mg, 第4批均質(zhì)量最高, 為0.70 mg;8日齡稚魚(yú)在 Petrifilm干膜上平均細(xì)菌數(shù)目是11×104CFU/仔魚(yú), 其中第一批仔魚(yú)的菌數(shù)均值最低,為 2×104CFU/仔魚(yú), 第 7批菌數(shù)均值最高, 為2×105CFU/仔魚(yú); 對(duì)同批次仔魚(yú), 在 TCBS霍亂弧菌（Vibrio cholerae）培養(yǎng)基上弧菌 NP的數(shù)目范圍是3×103～3×104CFU/仔魚(yú), 均值為 17×103CFU/仔魚(yú); 9日齡稚魚(yú)在弧菌NP、弧菌P、無(wú)弧菌感染（對(duì)照組）3種條件下48 h內(nèi)的平均成活率分別為82%、46%和80%, 其中在弧菌P感染條件下, 第二批稚魚(yú)的成活率最低, 僅為 0.7%, 第 6批稚魚(yú)的成活率最高, 為85%。稚魚(yú)在弧菌NP和無(wú)弧菌感染兩種條件下的成活率的相關(guān)性極高（相關(guān)系數(shù)r=0.93）, 在當(dāng)前試驗(yàn)條件下弧菌 NP對(duì)大菱鲆仔稚魚(yú)的存活不存在有害作用, 而弧菌P對(duì)仔稚魚(yú)則有顯著影響。顯然, 通過(guò)弧菌NP感染仔稚魚(yú)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)意義不大。在仔稚魚(yú)非感染條件下, 成活率、平均體質(zhì)量、細(xì)菌數(shù)目等常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)間不相關(guān), 只有在細(xì)菌感染條件下, 上述標(biāo)準(zhǔn)間才存在相關(guān)。通過(guò)對(duì)仔稚魚(yú)進(jìn)行感染試驗(yàn), 可以揭示仔稚魚(yú)質(zhì)量所隱藏的內(nèi)在特征。

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（本文編輯: 譚雪靜）

Q33

A

1000-3096（2011）01-0098-07

2010-04-07;

2010-11-12

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（nycytx-50）; 國(guó)家支撐計(jì)劃專(zhuān)題項(xiàng)目（2006BAD01A12012）; 農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（nyhyzx07-046）; 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2009-ts-11）

馬愛(ài)軍（1971-）, 女, 山東榮成人, 研究員; 主要從事海水魚(yú)類(lèi)繁育與遺傳育種研究, E-mail:maaj@ysfri.ac.cn;電話:0532-85835103