一種能源微藻IOAC689S的篩選和優化培養

劉 倩, 何梅琳, 李 凌, 于文俊, 徐年軍 劉建國

（1. 寧波大學 生命科學與生物工程學院, 浙江 寧波 315211; 2．中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071）

一種能源微藻IOAC689S的篩選和優化培養

劉 倩1,2, 何梅琳2, 李 凌2, 于文俊2, 徐年軍1, 劉建國2

（1. 寧波大學 生命科學與生物工程學院, 浙江 寧波 315211; 2．中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071）

利用氯仿-甲醇（2:1）提取和氣相色譜技術, 對采集自渤海、黃海、東海、南海海域以及實驗室現有的海洋微藻進行了總脂和脂肪酸檢測, 從中篩選到一株高產油微藻 IOAC689S, 其油脂含量在快速生長階段達到37.5%, 其中可作為生物柴油開發的18C以下脂肪酸占總脂肪酸的91.03%。通過對其ITS和5.8S rDNA全序列進行擴增, 得到了包括18S rDNA及28S rDNA部分序列在內的全長為998bp的DNA片段, 初步確定為一種綠藻。隨后利用氧電極檢測藻液凈光合放氧速率的方法, 研究了光照強度、溫度、鹽度、pH值、碳源、N和P濃度等不同理化因子對IOAC689S光合作用的影響, 從而得到該藻優化后的培養參數如下: 光照強度200 μmol/（m2·s）、光下培養溫度30～35℃, 黑暗培養溫度24℃、鹽度30、pH值7～9、NaNO3氮源質量濃度75 mg/L、NaH2PO4磷源質量濃度40 mg/L, 而NaHCO3碳源對該藻生長沒有明顯作用。利用上述優化條件培養該藻獲得了較好生長效果, 平均比生長速率為0.210 d?1,每周生物量可增加3.8倍。實驗結果還表明在培養后期當pH值提高至10～11時, 藻體易發生沉降, 可以利用該特性進行藻體收獲。

生物柴油; 光合放氧; 脂肪酸; 優化培養; 微藻

傳統化石燃料資源緊缺且具有不可再生、易產生環境污染等問題, 目前國際上很多國家正在尋求一種可再生無污染的新型清潔能源作為替代能源, 用以緩解日益嚴峻的能源危機。其中, 利用玉米甘蔗和大豆等農作物為原材料生產生物柴油并部分取代化石燃料,已經在巴西和美國等少數國家得到應用。然而此方法存在與人爭糧、與糧爭地等問題, 與食品安全存在嚴重沖突, 特別不適宜于人口眾多、人均耕地面積少的中國國情。同高等植物相比, 微藻特別是海洋微藻生產生物柴油優勢明顯, 如光能利用效率更高、生長繁殖更快、可利用海水以及可在鹽堿荒地上通過光生物反應器進行高密度生產而不占用耕作土地資源等, 因此微藻生物柴油開發受到了國內外的特別關注。

眾所周知, 含油量和細胞繁殖速度是評價微藻是否適合生物柴油開發最基礎也是最關鍵的 2個指標, 通常兩者存在負相關關系。Brown等報道葡萄藻含油量最高能夠達到 80%以上[1], 但其生長速率非常緩慢[2-3], 因此難以進行生物柴油開發。到目前為止, 有希望用于生物柴油開發的幾株藻株包括Chlorellasp.,Isochrysissp.,Phaeodactylum tricornutum,Dunaliellasp. 和Nannochlorissp.等, 一般生長相對較快同時含油量相對較高, 約為20%～30%[4-7]。為篩選得到含油量更高同時生長也較快的藻株, 作者對實驗室保存的微藻和新近從中國沿海分離的微藻進行了篩選, 發現其中藻株 IOAC689S不僅含油率高（37%左右）, 而且90%的脂肪酸鏈長與柴油接近,同時生長速度比較快等特點, 非常適合于微藻柴油開發, 本文將相關實驗結果予以報道。

1 材料與方法

1.1 藻種來源和基本培養條件

在實驗篩選藻株中, 部分株系從我國渤海、黃海、東海、南海不同站點分離得到, 即借助海上科學考察機會隨船出海并采集水樣, 分別利用孔徑大小不一的濾網按照微孔從大到小的順序逐級過濾, 仔細收集濾液, 將采集到的水樣保活運輸到實驗室,然后結合稀釋、顯微挑選和涂布等傳統微生物分離方法對藻株進行分離和純化, 挑選出單細胞藻落,從中獲得純化海洋微藻藻株。另一部分藻株系中國科學院海洋研究所海洋生物技術中心室保存藻種。

上述實驗篩選藻株（包括 IOAC689S等）均以Guillard和Hargraves的 L1海水培養基為基礎[8], 采用間歇性培養在溫度 24℃±0.1℃、光照周期 12 h:12 h、光照強度40 μmol/（m2·s）條件下進行間歇性培養, 培養期間每天定時搖瓶8次。

1.2 DNA序列測定及分析方法

DNA 的提取: 取對數生長期的藻液, 在 4 000 r/min和4 ℃離心10 min, 棄上清, 沉淀藻體用150 μL Milly-Q水重懸后置于離心管中, 采用TaKaRa基因組DNA提取試劑盒提取并純化藻株基因組DNA。

PCR擴增及其產物的純化、克隆: 參照文獻[9]設計引物擴增其ITS1、5.8S rDNA及ITS2全序列。引物序列為: For 5’-GAAGTCGTAACAAGGTTTCC-3’; Rev 5’-TCCTGGTTAGTTTCTTTTCC-3’。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR 反應條件如下: 95℃預變性5 min; 95℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35個循環; 72℃延伸10 min。PCR 反應體積為25 μL, 其中包括DNA 模板50 ng、Taq DNA 聚合酶 0.2 μL（1U）、引物（10 μmol/L） 各1 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、10 ×buffer 2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL 和 ddH2O 15.8 μL。擴增反應在TaKaRa-TP600型PCR 儀上進行。PCR擴增產物以 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測, 從膠上回收目的DNA片段, 純化后連接到 pMD18-T載體（TaKaRa）上。參照薩姆布魯克等[10]轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞, 挑取陽性轉化子。

菌液選取后送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。所得序列用Vector NTI軟件進行拼接, 然后在 NCBI 服務器上（http://www.ncbi.nih.gov）用BLAST 進行同源檢測。

1.3 生物量測定

培養過程中藻生物量的變化采用葉綠素含量指標間接表示[11], 葉綠素采用傳統的丙酮法提取, 并利用722型可見分光光度計檢測645 nm和663 nm波長下的光吸收, 葉綠素含量按照下列公式計算[11]:Chlorophyll a （mg/L） = （12.7×A663nm?2.69×A645nm） ×稀釋倍數。

培養后期藻體生物量采用干重法測定。藻體收獲采用離心法, 藻泥用pH4.0的稀HCl沖洗3次, 去除沉淀在藻體表面的礦物質, 藻體采用真空冷凍方法干燥, 藻體質量以電子天平稱量。

1.4 粗脂提取和脂肪酸檢測方法

粗脂的提取參照Bligh and Dyer方法[12], 脂肪酸含量分析采用氣相色譜法, 上機前預處理采用硫酸-甲醇法[13-14]。氣相色譜儀采用上海精密科學儀器有限公司產 GC-112A; 脂肪酸測試條件為色譜柱:OmegawaxTM320: 30 m×0.32 mm×0.25 μm; 程序升溫條件: 自 60℃以 20 ℃/min速率升至 150 ℃并停留2 min, 再以4 ℃/min速率升至265 ℃。利用標準參照樣品標定各脂肪酸出峰時間和順序, 脂肪酸含量以其峰面積參比內標C17的含量和面積進行計算。

1.5 生長條件逐級優化

生長條件優化按照光合放氧和呼吸耗氧方法,藻液中溶氧量采用OXY-LAB液相氧電極（Hansatech,英國）精確檢測, 以單位時間內液體中溶解氧變化計算放氧和耗氧速率, 進而反映微藻生長對不同培養條件的需求。光合溶氧測定過程中外接恒溫水浴鍋控制溫度, 轉子轉速保持在80 r/min, 以波長660 nm的冷紅光為光源。藻液均取自對數生長期藻體且濃度維持在A750nm=0.4, 每個樣品測定重復3次以上。

逐級優化培養條件時以L1海水培養基為基礎,先進行光強優化[15], 在選取最佳光照強度基礎上再進行溫度優化, 然后根據最適光溫進行酸堿度優化實驗, 依次類推。培養參數的優化按照光強、溫度、pH、氮、磷濃度和碳源濃度和鹽度的順序逐級完成。

其中, 為保障氮、磷營養鹽優化實驗的準確性,實驗前離心收獲 IOAC689S藻泥, 將其重新接種到無N、P的培養液中洗滌和饑餓處理, 以減少培養液中和藻細胞內殘余N、P影響。具體操作如下: 將藻液4 000 r/min離心濃縮后, 用無N、P的L1培養基清洗濃縮液 3次, 然后將離心收集的藻液均分兩份,一份置于無氮改良 L1培養基中, 一份置于無磷改良L1培養基中, 在光強 40 μ mol/（m2· s）、光暗比 12 h:12 h、溫度24℃±0.1℃條件下, 培養72 h, 分別達到N、P饑餓處理效果。然后將經氮饑餓處理過的藻液接種到氮源NaNO3梯度為0、18.8、37.5、75、150、300和600 mg/L的修正L1培養基中培養48 h, 并檢測其凈光合放氧速率。同樣磷實驗采用的 NaH2PO4梯度為 0、10、20、40、80、160和 320 mg/L, 實驗培養48 h后檢測其凈光合放氧速率。

2 結果與分析

2.1 含油藻種的篩選

實驗過程中對綠藻門（27株）、硅藻門（13株）、金藻門（15株）共55株海洋微藻進行總脂和脂肪酸檢測,得到總脂含量在30%以上的9株（其中綠藻3株, 金藻5株, 硅藻1株）, 20%～30%的23株（其中綠藻13株, 金藻6株, 硅藻4株）, 20%以下的23株（綠藻11株, 金藻4株, 硅藻8株）, 其中含油量最低的為一株杜氏藻（Dunaliellasp.）, 其總脂含量僅占干藻粉的10%, 而篩選出的一種含油量較高、生長速率也較快且適宜于人工培養生產生物柴油的藻株 IOAC689S,其總脂含量未經誘導情況下達藻粉干質量的37.5%。

該藻ITS1、5.8S rDNA和ITS2 片段經PCR反應后, 成功擴增出一條清晰明亮的條帶, 大小 998 bp,與預期片段大小相符（圖1）。經BLAST 分析, 發現藻株IOAC689S的DNA擴增片段與Nannochloropsissalina（EU165326）、Nannochloropsis granulata（EU165-324）、Nannochloropsis maritima（DQ074696）、Nannochloropsis limnetica（EU165325）和Nannochloropsis oceanica（DQ069777）中18S rDNA和28S rDNA部分序列在內的ITS1、5.8S rDNA和ITS2 全序列具有較高的同源性, 其相似性分別達到95%、81%、80%、81%和 80%。進一步序列比對表明, 本文所得 DNA片段包含18S rDNA部分序列40 bp, ITS1全序列325 bp, 5.8S rDNA全序列163 bp, ITS2 全序列393 bp和28S rDNA部分序列 77 bp。上述該序列已提交GenBank, 收錄號為 GU111540。結合藻細胞其他性狀、直徑5～12 μm, 健康藻體呈綠色, 懸浮狀態生長和顯微觀察結果確定藻株IOAC689S應為綠藻門。

圖1 IOAC689S的18S rDNA部分序列、ITS1、5.8S rDNA、ITS2全序列和28S rDNA部分序列Fig. 1 Partial sequence of 18S rDNA gene; complete sequence of ITS1, 5.8S rDNA gene, and ITS2; and partial sequence of 28S rDNA gene in strain IOAC689S

2.2 脂肪酸組成分析

藻株IOAC689S的脂肪酸組成的氣相色譜圖（圖2）表明, 該藻主要含有8種脂肪酸, 其中脂肪酸碳鏈長度小于 18C可作為生物柴油開發的占絕大多數,約占總脂肪酸含量91.03%, 而含量最多的16C脂肪酸含量達到總脂肪酸的69.54%。

2.3 生長條件的逐級優化

2.3.1 光照

圖2 IOAC689S脂肪酸的氣相色譜圖Fig. 2 Gas chromatogram of the fatty acids in strain IOAC689S

在溫度 25℃±0.1℃及光照強度 0～600 μmol/（m2·s）范圍內, 光照強度對該藻凈光合放氧速率的影響如圖3所示。光照強度小于 200 μmol/（m2·s）時,IOAC689S由耗氧轉變到放氧, 且凈放氧速率逐漸升至最大值 2.6 nmol/（mL·min）, 光照強度大于 200 μmol/（m2·s）時, 光合放氧速率開始緩慢下降。從圖3中可以得到: 該藻的光補償點在光強50 μmol/（m2·s）處, 光飽和點在 200 μmol/（m2·s）處。因此, 適宜IOAC689S光合作用的光照強度在 200 μmol/（m2·s）左右。

圖3 不同光強對IOAC689S凈光合放氧速率的影響Fig. 3 Effect of light intensity on net photosynthetic O2evolution of IOAC689S

2.3.2 溫度

最佳生長光強 200 μ mol/（ m2·s）條件下, 溫度在15、20、25、30、35、40、45℃變化時, 藻液每分鐘溶解氧變化情況如圖4所示。結果表明: 當溫度處于15～35℃范圍內, 藻液的凈光合放氧速率隨著溫度的增高而上升, 在 30～35℃時凈光合放氧速率達到最大值, 而當溫度進一步升高到 35℃以上凈光合放氧速率迅速下降, 到 45℃時呼吸耗氧速率超過了光合放氧速率, 凈光合放氧速率變為負值。因此, 適宜IOAC689S光合的溫度在相對較高的 35℃左右, 在生產上屬于較為耐熱的藻株, 比較適宜于在我國亞熱帶地區全年或溫帶地區從春、夏和秋季人工培養生產生物柴油。

圖4 不同溫度對IOAC689S凈光合放氧速率的影響Fig. 4 Effect of temperature on net photosynthetic O2evolution of IOAC689S

2.3.3 酸堿度

以氫氧化鈉和鹽酸調節藻液pH值分別到5、7、9、11、13, 在光暗比12 h:12 h、溫度24℃±0.1℃恒溫條件下預培養 24 h, 然后在最佳光強和溫度條件下, 研究不同pH對IOAC689S的凈光合放氧速率影響（圖5）。氧電極檢測結果表明在pH值5～7時藻凈光合放氧速率呈迅速上升趨勢并達到最大, pH值大于7時凈光合放氧速率迅速下降, pH值11～13時生長活性明顯降低, 到 pH值 13時凈光合放氧速率降到最低。適宜于IOAC689S光合與生長的pH在7～9之間。由于pH值變化與水體中無機碳源分布有密切關系, 上述結果意味著該藻可能主要以二氧化碳為碳源, 對碳酸氫根利用效率次之, 對碳酸根利用效率最差, 這點可從下面實驗中進一步證實。作者還注意到, 在培養過程中當pH值在5 ～ 9時, 藻液呈懸浮狀態生長; 但當pH值進一步增加至11以上時, 藻體雖然保持一定的生理活性但出現沉降。因此, 可充分利用該藻對pH值反映的上述特性進行藻體培養和收獲。

圖5 不同pH值下IOAC689S凈光合放氧速率的變化Fig. 5 Effect of pH on net photosynthetic O2evolution of IOAC689S

2.3.4 營養鹽

氮磷饑餓后的 IOAC689S在不同濃度氮、磷營養鹽的藻液中預培養適應 48 h, 然后在上述最佳光強、溫度和pH條件下測定凈光合放氧速率, 結果分別如圖6和圖7所示。其中, 氮質量濃度低于75 mg/L以下時, 凈光合放氧速率隨氮濃度升高迅速增大,氮質量濃度 75 mg/L時凈光合放氧速率達到最大;當氮質量濃度超過 75 mg/L后凈光合放氧速率開始降低, 意味著藻生長受到一定程度的抑制（圖6）。在磷質量濃度為 0～40 mg/L時, 該藻的光合放氧速率迅速上升, 并于磷質量濃度為 40 mg/L時達到最高（5 nmol/（mL·min）, 而磷源質量濃度升高到 40 mg/L后, 藻的光合放氧速率逐步下降, 整體放氧速率曲線呈拋物線狀（圖7）。因此適宜于IOAC689S生長的氮、磷營養鹽濃度分別為75 mg/L和40 mg/L。氮: 磷比率較低（接近2 : 1）, 表明該藻生長對磷需求相對較高。

圖6 氮濃度對IOAC689S凈光合放氧速率的影響Fig. 6 Effect of nitrate concentration on net photosynthetic O2evolution of IOAC689S

圖7 磷濃度對IOAC689S凈光合放氧速率的影響Fig. 7 Effect of phosphate concentration on net photosynthetic O2evolution of IOAC689S

2.3.5 無機碳源和鹽度

在最佳光強、溫度、pH和氮、磷營養鹽濃度條件下, 碳酸氫鈉對 IOAC689S凈光合放氧速率的影響如圖 8所示。藻凈光合放氧速率在不加入碳酸氫鈉時最高, 在加入碳酸氫鈉的情況下有所下降, 并且隨碳酸氫鈉濃度加大無明顯的波動, 這說明該藻光合作用并不需求碳酸氫鈉, 或者也可能是碳酸氫鈉的加入改變了藻液的酸堿度, pH值上升導致了其光合放氧速率發生了改變。

圖8 不同碳濃度對IOAC689S凈光合放氧速率的影響Fig. 8 Effect of sodium bicarbonate on net photosynthetic O2evolution of IOAC689S

同樣, 我們開展的鹽度實驗表明, 藻液鹽度對IOAC689S凈光合放氧速率存在一定影響, 其中自然海水鹽度即 30‰的培養液對其生長最為有利（結果未列出）。

綜上所述, 該產油藻株 IOAC689S的優化培養條件如下: 光照強度200 μmol/（m2· s）, 光照下溫度為30～35℃之間, 黑暗溫度24℃左右, 鹽度30, pH值7～9, 氮源質量濃度75 mg/L（NaNO3）, 磷源質量濃度40 mg/L（NaH2PO4）。

進一步利用上述優化的培養條件與未優化前的培養方法進行對比, 結果表明優化培養條件后IOAC689S的比生長速率由未優化時的 0.168 d?1增加到0.210 d?1, 凈增加25%, 生長培養時間明顯縮短;優化后IOAC689S平均每周生物量可增加3.8倍, 藻生物量積累速度得以加快。

另外, 作者比較了穩定期、對數期的藻體、高溫強光抑制下生長的藻體和氮磷營養鹽虧缺培養后的藻體總脂和脂肪酸含量, 發現其脂肪酸組成比例并沒有顯著改變, 而穩定期所收獲的藻產油量要高于對數期所收獲的藻（結果未列出）, 因此建議在藻生長到穩定期時進行收獲以獲得更多的油量。

3 討論

微藻生物柴油作為替代傳統化石燃料的可再生新型能源, 已經被證實是可行的[4], 選擇一種合適的藻種作為生物柴油原材料至關重要, 其中最基本的選擇標準就是具備高含油量和高生長速率。IOAC689S產油率不經誘導就達37.5%, 比大多數含油 20%～30%的產油藻株要高[4-7], 并且其 18碳以下的脂肪酸占總脂肪酸含量 90%以上, 適宜于開發生產生物柴油。同時, IOAC689S平均比生長速率可達到0.210d?1, 比含油非常高的葡萄藻最大比生長速率0.095d?1[3]要高很多。因此, IOAC689S兼有高含油量和高生長速率雙重特性, 同時對溫度需求在較高的 30℃～35℃之間, 因此是比較好的海洋產油微藻藻株。

溫度優化實驗中顯示 35℃時該藻的凈光合放氧速率最高, 但在 35℃長期培養時藻體出現生長不健康的現象, 這可能是因為液相氧電極所測結果反映的僅是藻體在短期內的凈光合放氧情況, 而參與光合作用的一部分酶類若長時間處在高溫的狀態下會鈍化甚至失活所造成的。同時, 由于黑暗狀態時較高的溫度能夠使得藻呼吸作用加強, 因此為避免白天積累的有機物和能量在夜間被迅速轉化, 加快藻體生長速度和生物量積累速度, 藻體夜間培養溫度最好低于白天, 我們建議培養溫度在光照條件下為30～35℃之間, 而夜間黑暗條件下24℃左右。

微藻個體較小, 懸浮性強, 通常難以有效收獲,收獲成本較大, 限制著該藻產業的進一步發展, 因此尋求簡易快速、經濟廉價的有效收獲工藝方法成為該產業關注的重要技術。針對IOAC689S而言, 該藻在近中性和微堿性環境（pH 值 7～9）中具有最佳生長速率, 當 pH值升高至 11時藻體雖然仍具有一定活性, 但容易出現沉降。我們可以充分利用IOAC689S的上述特性, 在生產前期通過控制pH值在9以下培養實現生物量增加; 然后, 在培養后期通過pH值自然升高方法造成藻體自然沉降, 在花費較少的前提下實現藻體第一步濃縮, 大大減少設備投入和能源消耗, 降低收獲成本, 然后再采用其他技術對濃縮藻液進行收獲。

IOAC689S藻株最適生長條件同很多中國近海區域的自然條件非常接近, 如對晝夜溫度、海水酸堿度和鹽度的要求等, 這種易于獲得的培養條件使其更能滿足微藻培養的規模化需求。我國擁有1.8萬公里長的海岸線, 1.5億畝鹽堿荒地, 適宜于規模化培養IOAC689S開發生物柴油。

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Received: Oct., 21, 2009

Key words:Bio-diesel; photosynthetic O2evolution; fatty acid; optimization; micro algae

Abstract:Total lipid contents and fatty acid compositions of marine microalgae collected from Bohai, Huanghai,Donghai, and Nanhai area and the ones that already existed in the lab of Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences were analyzed by chloroform-methanol （2:1） extraction and gas chromatography （GC） technology. Marine microalga listed as IOAC689S was unique and suitable for biodiesel production because of its high total lipid content （37.5%） and its high content （91.03%） of short- chain fatty acids （carbon chain length shorter than 18）. Total ITS and 5.8S rDNA sequences of this alga were amplified; and a length of 998 bp DNA fragment including 18S rDNA and 28S rDNA sequences was obtained. The changes of net photosynthetic O2evolution in IOAC689S under different culture conditions （including light intensity, temperature, pH, salinity, nitrate, phosphate and carbonate）were determined by an oxygen electrode. Optimized culture conditions were established （200 μmol/（m2·s） illumination, 30～35℃ in light and 24℃ in darkness, 30‰ salinity, pH 7～9, 75mg/L of NaNO3, 40 mg/L of NaH2PO4）.NaHCO3as carbon-source showed no significant effect on net photosynthetic O2evolution. Under the optimized culture conditions, 3.8 times biomass increase per week and 0.210 d?1of average specific growth rate were observed for IOAC689S. In addition, the alga easily flocculated at the late cell culture stages when the culture pH was gradually adjusted to 10 or above. This flocculation can be used for biomass harvesting.

（本文編輯:張培新）

A biodiesel producing micro-algal strain IOAC689S and optimization of its culture parameters

LIU Qian1,2, HE Mei-lin2, LI Ling2, YU Wen-jun2, XU Nian-jun1, LIU Jian-guo2

（1. Faculty of Life Science and Biotechnology of NingBo University, 315211 Ningbo, China; 2. Institude of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China）

S963.21+1

A

1000-3096（2011）01-0029-07

2009-10-21;

2010-03-10

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2008AA09Z403）;國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2011CB200904）; 中國科學院知識創新工程重要方向項目（KGCX2-YW-373-3）

劉倩（1985-）, 女, 碩士研究生, 研究方向: 藻類與藻類生物技術, E-mail: jgzqliu@126.com; 通信作者, 劉建國, E-mail: jgliu@qdio.ac.cn