江蘇省揚州地區胃癌組織中EB病毒感染與p53蛋白表達的相關性

顧學文,肖 芹,王翠梅,陳月香,張真穩

(揚州大學臨床醫學院,1.病理科;2.內分泌科,江蘇揚州,225001)

Epstein-Barr病毒(EBV)是一種DNA腫瘤病毒,與許多人類惡性腫瘤的發生有密切關系。已經證實其與多種腫瘤的發生有關,如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病,以及其他一些器官的淋巴上皮性腫瘤[1]。近年來國內外學者研究顯示約10%的胃癌組織EBV陽性,EBV感染與胃癌發生有相關性,但存在地區性差異[2]。胃癌是世界范圍內死亡率居第2位的惡性腫瘤,在我國居各類惡性腫瘤之首,其發生和發展涉及多種癌基因和抑癌基因激活和丟失。本研究旨在探討揚州地區胃癌患者EBV感染與抑癌基因p53表達的相關性,并進一步分析EBV致癌的可能機制,以期為臨床對EBV相關胃癌的預防、診斷、治療提供一定的理論依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

96例胃癌組織為本院2007年1月～12月外科手術切除標本。其中男67例,女29例,年齡28～82歲,中位年齡51歲。其中高分化腺癌28例,中低分化腺癌47例,黏液腺癌 10例,黏液細胞癌11例。

1.2 試劑及實驗方法

1.2.1 原位雜交:采用荷蘭Pan Path公司生產的EBERl原位雜交試劑盒進行原位雜交:石蠟切片經二甲苯脫蠟,乙醇梯度水化,胃酶消化后,與地高辛標記的EBER1寡核苷酸探針進行變性、雜交反應,洗去剩余探針,用辣根酶標記鼠抗地高辛抗體孵育,DAB液顯色,蘇木素復染,中性樹膠封固,鏡檢觀察。以EB病毒陽性的鼻咽癌組織切片作為陽性對照,以已知EB病毒陽性的鼻咽癌組織切片,將無探針雜交液替代EBER探針作為陰性對照。

1.2.2 免疫組化:全部標本均經10%中性甲醛液固定,石蠟包埋,4 μ m厚連續切片。鼠抗人p53單克隆抗體購自北京中山生物公司,EnVision試劑盒購自DAKO公司。采用免疫組化EnVision兩步法,實驗步驟按說明書進行,用已知陽性片作陽性對照,以PBS緩沖液取代一抗作陰性對照。

1.2.3 結果判斷:原位雜交結果判斷:EBER1陽性細胞核呈棕黃色,在核內及核仁中均可見EBER1表達,而EBER1陰性細胞不著色呈蘇木素復染的顏色。免疫組化染色結果判斷:細胞核中呈現均勻棕黃色顆粒分布判為陽性;選取切片中陽性表達最強的10個視野,根據陽性細胞數量的多少,分成-～ 級,其中-:0;+:1%～25%;

:26%～50%; :51%～75%; :76%～100%。陰性結果不顯色,顯示復染的藍色。

2 結 果

2.1 EBERl原位雜交結果

EBERl陽性細胞核呈棕黃色,陽性信號幾乎表達在所有癌細胞中,陽性細胞大多為+～ ,而EBERl陰性細胞不著色呈復染的藍色。96例胃癌癌組織標本中檢測到15例EBER1陽性,陽性率為15.6%;15例陽性標本中男12例,女3例;有11例癌間質中有大量淋巴細胞浸潤;陽性標本均為腺癌,其中高分化腺癌3例,中、低分化腺癌12例。印戒細胞癌及黏液腺癌未見陽性反應。相應癌旁組織均未檢測到EBV感染,2者EBER1陽性率差異有顯著性(P<0.05)。提示EBV感染與胃癌的發生有關,癌間質中大量淋巴細胞浸潤可能是EB病毒感染的重要病理學特征。見圖1。

圖1 EB病毒在胃癌組織中彌漫陽性,原位雜交法,DAB顯色 (200倍)

2.2 免疫組化染色結果

96例胃癌癌組織標本中p53陽性46例,陽性率 47.9%(46/96),相應癌旁組織均為陰性。胃癌組p53蛋白陽性率明顯高于癌旁組織組,兩組間有顯著性差異(P<0.01)。在15例EBV陽性胃癌(EBVaGC)組織標本中 p53陽性11例,見圖 2,陽性率 73.3%(11/15);81例EBV陰性(EBVnGC)組織標本中p53陽性35例,陽性率43.2%(35/81);2組間有顯著性差異(P<0.01)。提示 EBV陽性胃癌與p53蛋白表達有相關性。

圖2 EBVaGC組織中p53蛋白陽性,EnVision免疫組化法 (200倍)

3 討 論

胃癌是本地區最常見的惡性腫瘤之一,其發生與演變是一個漸進的過程,涉及多種原癌基因的激活及抑癌基因的失活。EB病毒是與人類密切相關的病毒之一,幾乎所有的成人都被其感染過,與人類的許多惡性腫瘤有關[1]。EB病毒感染的細胞可表達EB病毒核抗原(EBNA s)、隱性膜蛋白(LMPs)和小分子non-polyadenylatedRNA s(EBER s)等[3-4]。其中由于EBER1在細胞核中表達豐富而穩定,故是目前廣泛應用的檢測EB病毒感染的敏感指標,并特別適于檢測石蠟包埋的病理切片。自1991年Shibata等[3]首次在胃癌細胞中發現EBV以來,國內外對EBV與胃癌相關研究逐漸增多,國外研究報道胃癌EBV感染檢出率7.3%～16.9%[3,5],國內研究報道胃癌感染檢出率1.6～20.7%[6],存在明顯地區差異。本研究顯示本地區96例胃癌組織標本,有15例癌組織EBERl陽性,陽性率為15.6%;而癌旁正常組織無EBERl表達。EBVaBC組織中幾乎所有癌細胞均有EBERl表達,并有明顯的間質淋巴細胞浸潤,均為普通型腺癌,表明感染EBV的瘤細胞為單克隆增生,從而推測EBV感染應發生在胃癌形成早期,提示EBV感染與本地區部分胃癌的發生確實存在密切關系。同時間質內淋巴細胞浸潤可能是 EB病毒感染的重要組織學特征之一。

Okano等[7]提出,經過EBER1原位雜交技術證實胃癌細胞存在EBV者定義為EBVaGC。p53基因是一個廣譜的抑癌基因,大約50%的人類腫瘤與p53基因的突變、過量表達或雜合性丟失有關。細胞周期失控是腫瘤發生的重要原因,p53基因在控制細胞周期和細胞凋亡的過程中發揮著重要作用。突變型p53基因和蛋白構型發生改變是腫瘤形成的關鍵。p53基因異常與胃黏膜細胞的癌變過程密切相關[8]。但EBVaGC中EBV與p53的相互作用尚無定論。EBV與癌基因和抑癌基因的相互作用成為EBV相關胃癌(EBVaGC)發生機制的研究熱點。癌基因和抑癌基因功能變化在EBVaGC發生發展中所起作用因EBV的參與而與其在EBV陰性胃癌(EBVnGC)中的作用有所不同[9],國內學者高瑞萍等[10]采用PCRSSCP技術對胃癌組織標本p53基因外顯子5-8的突變情況進行檢測,發現EBV陽性組p53基因突變率高于EBV陰性組,認為EBV感染可能促進了p53基因的突變和積累。李淑英等[11]報道EBV感染可能與p53基因表達呈正相關。Luo等[12]研究提出p53蛋白在瘤細胞中的累積可能是p53基因突變引起,也可能是野生型p53與EBV蛋白相互作用的結果。本研究,15例EBV陽性組中有11例p53蛋白陽性表達,其陽性率為73.3%,EBV陰性組中 p53蛋白陽性率為43.2%,EBV陽性組p53蛋白表達陽性率顯著高于EBV陰性組,提示EBV感染與p53蛋白在胃癌中過表達有明顯關系,可能對胃癌的發展起促進作用。

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[7]Okano M,Gross T G.Acute or Chronic Life-Threatening Diseases Associated With Epstein-Barr VirusInfection[J].Am J Med Sci,2011.[Epub ahead of print]

[8]Wang J Y,Lin S R,Hsich J S,et al.Mutations of p53 gene in gastric carcinoma in Taiwan[J].Antieancer Res,2003,21(1):513.

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[11]李淑英,高金蘭,夏慶安,等.唐山地區胃癌患者 EB病毒感染與p53基因表達的關系[J].腫瘤研究與臨床,2006,18(2):100.

[12]Luo B,Wang Y,Wang X F,Gao Y,et al.Correlation of Epstein-Barr virus and its encoded proteins with Helicobacter pylori and expression of c-met and c-myc in gastric carcinoma[J].World J Gastroenterol,2006,12(12):1842.