全反式維甲酸對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的干擾

王春來 李晶晶

全反式維甲酸［1，2］是維生素A相關(guān)藥物，在臨床上已成功用于治療白血病，具有抑制細(xì)胞增生及誘導(dǎo)分化作用。最近其對(duì)腎臟病的治療尤其是抑制炎細(xì)胞浸潤及肌成纖維細(xì)胞增生方面，開始受到重視。腎小管間質(zhì)損害程度與腎小球?yàn)V過率成負(fù)相關(guān)，且比腎小球病變更能預(yù)測(cè)預(yù)后［3，4］，腎小管間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰的共同途徑。本文旨在探討維甲酸對(duì)UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。

1.材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重(250～300)g(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(假手術(shù)組)10只;模型組(UUO組)10只;給藥組(all-trans-retinoic acid治療組)10只。模型組及給藥組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù):3.8%的水合氯醛1mg/kg腹腔麻醉，常規(guī)碘酒酒精消毒，腹正中切口進(jìn)入腹腔，暴露左腎，沿左腎下極尋找到左輸尿管并游離，在離左腎下極0.3cm處用絲線上下結(jié)扎兩處輸尿管，然后從中剪斷以防逆行性感染，逐層縫合。假手術(shù)組只游離但不結(jié)扎和剪斷輸尿管，其他手術(shù)過程同另兩組;給藥組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后，每天予維甲酸(10mg/kg)灌胃，前兩組每天給予等量生理鹽水灌胃。每組大鼠飼養(yǎng)至9天后，處死，取梗阻側(cè)腎，分別固定于福爾馬林溶液中。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 維甲酸all-trans-retinoic acid(重慶華邦制藥股份有限公司);兔抗人結(jié)締組織生長因子多克隆抗體(武漢博士德有限公司);小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(美國抗體診斷公司);sp工作液試劑盒(北京中山公司)

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 組織學(xué)檢查 腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，切片厚2μm，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色及馬松三色染色(Masson)染色，觀察腎小管間質(zhì)病變，由兩個(gè)觀察者對(duì)每個(gè)樣本腎組織的HE染色及Masson染色進(jìn)行盲法評(píng)分，取兩觀察者評(píng)分的平均值。對(duì)腎小管間質(zhì)損害程度采用百分比評(píng)分法進(jìn)行評(píng)估，每張標(biāo)本低倍鏡下(100×)依序單盲觀察左上、右上、左下、右下、中間5個(gè)腎小管間質(zhì)視野，根據(jù)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎小管擴(kuò)張，腎小管萎縮，間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化等表現(xiàn)的范圍進(jìn)行評(píng)分。無變化為0分，范圍＜25%為1分，25% ～50%為2分，范圍＞50%為3分。分別計(jì)算評(píng)分，然后計(jì)算平均值，作為該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。腎間質(zhì)浸潤的炎細(xì)胞數(shù)，按文獻(xiàn)描述的方法［5］，400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不含腎小球的視野，計(jì)算腎間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)結(jié)果以(炎細(xì)胞/HP×400表示)。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 4μm的石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制的3%的過氧化氫10分鐘，CTGF微波修復(fù)抗原，以蛋白阻斷液阻斷20分鐘，CTGF滴加兔抗人CTGF多克隆抗體(1∶200)，α-SMA滴加小鼠抗大鼠α-SMA抗體，4℃孵育過夜，然后加入生物素化第二抗體，室溫20分鐘，再加鏈霉素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物工作液，室溫20分鐘，最后用DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，最后以蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，實(shí)驗(yàn)同時(shí)以PBS替代一抗做陰性對(duì)照。取各組標(biāo)本的免疫組化切片，用計(jì)算機(jī)圖象分析軟件(CMIAS系列多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng))對(duì)所選視野內(nèi)的免疫組化陽性信號(hào)進(jìn)行計(jì)算機(jī)讀片，以陽性染色區(qū)域的積分光密度值做半定量分析測(cè)定值。

2.結(jié)果

2.1 維甲酸對(duì)腎間質(zhì)病理損害的影響 UUO模型第9天，腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞變性和脫落、腎間質(zhì)增寬，伴單個(gè)核白細(xì)胞浸潤，甚至出現(xiàn)較嚴(yán)重的腎小管損害和腎間質(zhì)纖維化，腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分分值顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，維甲酸治療組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分分值顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，見表1。

表1 各組腎間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分

2.2 維甲酸對(duì)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤的影響 假手術(shù)組僅偶見個(gè)別炎性細(xì)胞。UUO模型組炎細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)浸潤逐漸增多，浸潤的巨噬細(xì)胞主要集中在腎小管間質(zhì)損害顯著處，維甲酸顯著抑制腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)胞數(shù)(巨噬細(xì)胞)顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，見表2。

表2 各組腎間質(zhì)炎細(xì)胞數(shù)(炎細(xì)胞/HP×400表示)

2.3 維甲酸對(duì)腎間質(zhì)α-SMA表達(dá)的影響 α-SMA是平滑肌和肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。UUO模型組α-SMA陽性染色區(qū)域主要集中在腎小管間質(zhì)病理損害嚴(yán)重處，個(gè)別腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA，但腎小球未見有α-SMA細(xì)胞。維甲酸治療組間質(zhì)α-SMA陽性染色區(qū)域與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，腎間質(zhì)總α-SMA陽性染色區(qū)域與腎小管間質(zhì)損害程度呈顯著正相關(guān)(r＜0.931)，提示肌成纖維細(xì)胞在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用，見表3。

2.4 維甲酸對(duì)腎間質(zhì)CTGF表達(dá)的影響 CTGF在假手術(shù)組腎間質(zhì)區(qū)無或僅有微量表達(dá)，在模型組腎間質(zhì)可見較多的散在的片狀分布，以髓質(zhì)區(qū)最明顯，而腎小球未見陽性表達(dá)，而治療組明顯減輕(P＜0.01)。免疫組化半定量分析，見表3。

表3 維甲酸治療對(duì)腎間質(zhì)α－SMA、CTGF的影響

3.討論

UUO模型是目前廣泛用于研究腎間質(zhì)纖維化比較成熟的動(dòng)物模型，它所致的腎間質(zhì)纖維化，與尿路壓力升高、缺血、缺氧、炎細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和生長因子表達(dá)增加等因素有關(guān)［6］，具有無高血壓、無蛋白尿、無血脂異常及無免疫和毒性損害等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)UUO術(shù)后9天，小管間質(zhì)纖維組織增生、炎細(xì)胞浸潤及細(xì)胞增殖明顯，部分小管不同程度萎縮、管腔閉塞或擴(kuò)張、壞死，小管間質(zhì)區(qū)面積擴(kuò)大，小管細(xì)胞基底膜不同程度斷裂增厚;與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］，以上結(jié)果表明該動(dòng)物模型的建立是成功的。

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同最終通路，因此如何防止和控制腎間質(zhì)纖維化對(duì)延緩慢性進(jìn)行性腎臟疾病的發(fā)展至關(guān)重要。

維甲酸是維生素A活性代謝產(chǎn)物，它通過與維甲酸受體RAR-α，β，γ和 BXR-α，β，γ結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化和影響胚胎發(fā)育，對(duì)多種細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增生有抑制作用［8，9］，還具有抗炎和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成等作用。本研究顯示在防治腎間質(zhì)纖維化方面，全反式維甲酸具有減輕UUO大鼠腎小管間質(zhì)病理改變的作用，病理結(jié)果顯示全反式維甲酸組腎小管損傷和間質(zhì)纖維化程度較UUO組明顯減輕，小管間質(zhì)病理損傷評(píng)分P＜0.05。

本研究顯示維甲酸可以明顯減輕腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，與對(duì)照組相比炎細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)。T淋巴細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞［10］為多數(shù)情況下腎小管間質(zhì)病變中的主要浸潤細(xì)胞，可通過釋放淋巴因子、炎癥介質(zhì)、上調(diào)趨化因子或黏附分子的表達(dá)促進(jìn)腎臟固有細(xì)胞或其自身的活化。外周血中的單核細(xì)胞在各種單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1、RANTES)的趨化作用下可浸潤腎間質(zhì)，活化并增殖為大量的巨噬細(xì)胞。最近的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，人們注意到單核巨噬細(xì)胞浸潤與腎間質(zhì)纖維化同步。

以往的組織病理技術(shù)很難區(qū)別浸潤的細(xì)胞類型，現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展使人們得以進(jìn)一步認(rèn)清浸潤細(xì)胞的種類，除炎癥細(xì)胞外，還有肌成纖維細(xì)胞。α-SMA是平滑肌細(xì)胞和肌成纖維的標(biāo)記蛋白，而肌成纖維細(xì)胞在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組化方法觀察腎間質(zhì)中α-SMA表達(dá)以明確肌成纖維細(xì)胞的增殖情況。肌成纖維細(xì)胞積聚產(chǎn)生過多的ECM，可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過面積下降，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。維甲酸治療顯著抑制腎間質(zhì)α-SMA，提示維甲酸能減少腎間質(zhì)成纖維積聚和細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

維甲酸抑制肌成纖維細(xì)胞積聚的機(jī)制如何?本研究通過免疫組化的方法檢測(cè)了CTGF。CTGF是TGF-β1的下游因子，而TGF-β1致纖維化已得到證實(shí)。CTGF是TGF-β1活性的調(diào)節(jié)者，CTGF抗體或反義寡核苷酸可減少TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。維甲酸治療顯著抑制腎臟CTGF表達(dá)，因此維甲酸可能通過下調(diào)腎臟TGF-β1、CTGF表達(dá)而抑制腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞增生。

維甲酸能夠減輕UUO模型腎小管間質(zhì)損傷，減少炎細(xì)胞浸潤，抑制α-SMA、CTGF表達(dá)，減輕腎間質(zhì)纖維化，可望成為治療腎間質(zhì)纖維化的有前途藥物。

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