EGFR基因rs2293347多態對吉非替尼治療非小細胞肺癌臨床療效的影響

馬飛 徐兵河 林東昕 孫瞳 石遠凱

吉非替尼（gefitinib, ZD1839）是近年來腫瘤靶向治療成功的典范，屬于EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑，目前主要應用于晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的臨床治療[1]。吉非替尼從研發到臨床應用以來，藥物療效相關因素的研究就一直是熱門。研究[2]提示遺傳相關因素可能是影響吉非替尼療效的關鍵性因素。而單核苷酸多態性是最常見的遺傳變異形式，也是導致許多藥物療效個體差異的重要因素[3]。本課題組曾通過藥物靶標基因-表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因的全基因篩選策略，發現EGFR基因rs2293347多態可能與吉非替尼的療效相關[4]，為此進行了深入的臨床研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 用于單核苷酸多態性分析的病例均來自中國醫學科學院腫瘤醫院2004年1月-2006年12月接受吉非替尼單藥治療的晚期NSCLC患者，共88例。所有患者均經組織學或細胞學診斷，治療前均具有可測量的靶病灶。其中男性39例，女性49例，中位年齡56歲（34歲-76歲）。患者PS評分均為0分-1分，80.5%的患者為非吸煙者，80.5%的患者為腺癌，其余19.5%為鱗癌或大細胞癌。所有患者均接受了吉非替尼的單藥治療，其中47例為二線治療，41例為三線治療。均采用RECIST標準評價近期療效，1例患者達到完全緩解（complete response,CR），32例患者達到部分緩解（partial response, PR），21例患者接受吉非替尼治療后病情穩定（stable disease,SD）超過24周，其余34例患者在治療24周內出現病情進展（progressive disease, PD），總體有效率為37.5%，將CR、PR、SD定義為吉非替尼治療有效（臨床獲益），PD患者定義為治療無效，臨床獲益率為61.4%。

1.2 rs2293347基因分型 采用PCR-RFLP（限制性片斷長度多態）的方法進行基因分型。分別采集所有患者抗凝外周靜脈血2 mL，酚-氯仿法提取模板DNA。采用PCR的方法擴增EGFR基因第25外顯子片段，PCR反應的引物分別為5’-ATGAGGTACTCGTCGGCATC-3’和5’-GAACCAAGGGGGATTTCATT-3’，產物大小為244 bp。25 μL PCR混合液中含0.1 μg模板DNA，引物濃度0.4 μmol/L，擴增條件為：95oC預變性2 min后，于94oC 30 s、60oC 30 s和72oC 30 s進行40個循環，最后72oC延伸7 min。PCR產物采用限制性內切酶Tfi I進行酶切，酶切溫度60oC，酶切產物經凝膠電泳分析，讀取基因型。

1.3 統計學分析 所有資料應用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，rs2293347基因型與臨床特征及近期療效關系的分析采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rs2293347基因分型結果 采用PCR- RFLP法對88例晚期NSCLC患者的外周血DNA進行了rs2293347基因分型。其中GG基因型63例，占71.6%；GA基因型24例，AA基因型1例，GA/AA基因型占28.4%。

2.2 rs2293347基因型與患者臨床病理特征及吉非替尼近期療效的關系 在88例接受吉非替尼單藥治療的晚期NSCLC患者中，將rs2293347不同基因型與患者臨床病理特征以及吉非替尼的近期療效進行分析，結果發現攜帶GG基因型的63例患者中，CR 1例（1.6%），PR 28例（44.4%），SD 16例（25.4%），PD 18例（28.6%），臨床獲益率為71.4%；攜帶AA基因型患者僅為1例，吉非替尼的臨床療效為PD；攜帶GA基因型患者為24例，其中PR 4例（16.7%），SD 5例（20.8%），PD 15例（62.5%），臨床獲益率僅為37.5%；攜帶GA/AA基因型患者臨床獲益率為36.0%。所有治療有效的患者中，GG基因型占83.3%，GA/AA基因型占16.7%；所有治療無效的患者中，GG基因型占52.9%，GA/AA基因型占47.1%。rs2293347基因型與吉非替尼的近期療效密切相關（P=0.002），但是與患者的年齡、性別、PS評分、吸煙狀況和病理類型均無明顯相關性（表1）。

2.3 rs2293347不同基因型患者的預后 rs2293347 GG基因型NSCLC患者經吉非替尼治療后，中位無進展生存期（progression free survival, PFS）為10個月，而rs2293347 GA/AA基因型患者的中位PFS為3個月，兩組相比有統計學差異（P=0.005）。GG基因型患者的中位總生存期（overall survival, OS）也比GA/AA基因型患者長（22個月vs 14個月），但兩組間差異無統計學意義（P=0.409）。

3 討論

分子靶向治療是近年腫瘤治療學領域新的里程碑，特異性抑制腫瘤細胞是分子靶向治療區別于傳統化療藥物的關鍵性特征，也正是這一特征，使得靶向治療適應人群的選擇性遠比傳統化療要嚴格。另外，目前靶向治療藥物十分昂貴，盲目地濫用靶向藥物是對醫療資源的極大浪費，這也要求靶向治療只能選擇性地應用于少數最可能獲益的患者人群。因此，如何預測分子靶向治療的療效以及選擇最可能獲益的目標人群，成為當前腫瘤靶向治療領域亟待解決的關鍵性臨床問題。

在吉非替尼的臨床實踐中，探尋療效預測指標一直是研究熱點。目前認為亞裔、女性、腺癌或無吸煙史的NSCLC患者往往對吉非替尼比較敏感[5]；EGFR的表達、酪氨酸激酶活性以及EGFR下游信號轉導也可能影響了藥物的敏感性[6]。另外，EGFR基因的突變與吉非替尼敏感性密切相關[7]。

表 1 88例吉非替尼治療患者臨床特征與EGFR基因rs2293347基因型的統計分析Tab 1 Stratification analysis of EGFR rs2293347 genotypes and clinical characteristics in 88 NSCLC patients treated with gefitinib

以上藥物療效相關因素研究中，不同研究者得到的結論不盡一致，甚至有些研究結論互相矛盾[1,8-10]，因此這些指標在臨床應用于預測吉非替尼藥物療效前還需要更為大宗的臨床研究加以證實。此外以上指標并不能全面解釋吉非替尼療效的個體差異。其它一些指標的檢測例如突變，操作煩瑣、費用昂貴、腫瘤組織來源困難，均限制了其臨床廣泛應用。因此，尋找簡便、經濟、準確性高的吉非替尼療效預測指標，對于指導NSCLC合理的個體化分子靶向治療具有重大的臨床意義。

目前研究提示遺傳變異主要為基因多態性可能是吉非替尼藥物療效差異的主要來源。本研究組前期曾開展了吉非替尼療效相關的多態性研究[11]，主要集中在重復序列數目差異（VNTR）。對NSCLC患者EGFR基因第1內含子區CA雙核苷酸單序列重復（CA-SSR）多態性進行了基因分型，結果發現攜帶短CA重復序列的患者吉非替尼的近期有效率明顯高于攜帶長重復序列的患者，但是CA-SSR多態性并不能影響吉非替尼治療后患者的無進展生存和總生存情況。

在人類基因組中數量龐大的單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism, SNP）才是個體間遺傳差異的主要來源。借助于高密度SNP圖譜的繪制和高通量基因分型技術的發展[12,13]，我們曾針對藥物靶標開展了全基因功能性SNP篩查，結果發現EGFR基因SNP位點rs2293347的基因型與吉非替尼的臨床療效可能相關[4]。本研究進一步確定了這種相關性，并且發現rs2293347還與患者的無進展生存密切相關。rs2293347作為同義SNP，位于EGFR基因第25外顯子這一功能活性區，但是并沒有導致EGFR受體氨基酸的改變（D994D）。雖然許多同義SNP也可影響mRNA穩定性、轉錄或剪切，從而影響蛋白表達、結構或功能[14-16]。但是rs2293347是否通過影響EGFR受體功能而對吉非替尼療效產生影響，確切的機制也有待于進一步的研究。

另外，SNP作為遺傳標記物預測吉非替尼的療效，在某些方面具有優于傳統預測指標（EGFR基因突變）的優勢。目前臨床上能夠獲得基因突變檢測標本的患者僅約20%（來自ISEL研究的數據）[17]，而所有患者均可以獲得SNP檢測的外周血標本，并且SNP檢測流程相對簡便、成本低廉。當然，rs2293347能否最終應用于臨床，補充甚至替代現有療效預測指標，還有待大宗的前瞻性臨床研究證實。