肺癌患者淋巴細胞亞群在外周血中的表達及其與預后的關系

羅君 凌志強 毛偉敏

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，5年生存率僅有10%-15%。近年研究發(fā)現(xiàn)肺癌常伴有免疫機能紊亂，許多研究[1-4]報道了免疫細胞亞群與臨床病理學資料之間的關系，卻鮮見外周血免疫學指標與預后關系的闡述。本研究采用流式細胞技術(shù)，根據(jù)白細胞表面抗原分化群（clusters of differentiation, CD）對淋巴細胞亞群的分類來檢測肺癌首診患者外周血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD25+、CD44+及NK細胞，以正常參考值做對照，結(jié)合臨床病理及隨訪資料進行分析，旨在探討淋巴細胞亞群與患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2006年8月-2007年12月在浙江省腫瘤醫(yī)院住院治療的221例肺癌首診患者資料，所有研究病例均經(jīng)纖維支氣管鏡或腫塊穿刺活檢明確診斷為肺癌，并且抽血化驗前均未行放療、化療或手術(shù)，排除嚴重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。年齡33歲-83歲，男性175例，女性46例，中位年齡59歲。181例患者接受了含鉑類兩藥聯(lián)合化療，其中78例患者在化療后3周-4周再次抽血復查。96例健康成年人作為對照組，選自本院體檢健康人群，年齡性別均與檢測組匹配。對全部肺癌患者進行電話隨訪，隨訪截止日期為2010年12月10日，其中失訪18例，失訪者在生存分析中以最近一次隨訪日期作為截尾值處理。

1.2 腫瘤分期及分化程度 腫瘤分期根據(jù)纖維支氣管鏡、胸部CT、B超等檢查結(jié)果，采用國際抗癌聯(lián)盟（international union against cancer, UICC）2002年肺癌第六版的TNM分期標準，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）188例：包括I期8例、II期7例、III期80例、IV期84例、無分期資料9例；小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）33例。低分化、未分化124例，高分化、中分化及高中分化24例，分化程度未知73例。

1.3 淋巴細胞亞群檢測

1.3.1 標本采集 221例患者和96例健康對照組于入院治療或體檢之前清晨空腹抽靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）鉀鹽抗凝。獲得標本后立即送檢。

1.3.2 試劑和儀器 采用美國Becton Dickinson公司FACS Calibur流式細胞儀和配套的淋巴細胞亞群檢測試劑盒（Smultest IMK-Lymphocyte），試劑盒中的雙色熒光抗體為異硫氰酸熒光素和藻紅蛋白標記的鼠抗人單克隆抗體（catalog No.340182）。

1.3.3 三色免疫熒光染色 采集血液2 mL，肝素抗凝，2 h內(nèi)送達實驗室。流式試管內(nèi)加相應單抗20 μL，加入肝素抗凝的待測血漿100 μL，混勻后室溫避光30 min充分反應。加2 mL溶血素2次，震蕩混勻，室溫避光5 min，1,200 rpm離心5 min，去上清后加磷酸鹽緩沖液震蕩混勻，1,200 rpm離心5 min，倒去上清，加固定液300 μL震蕩混勻。

1.3.4 流式細胞儀分析 使用Couter公司配套的System II系統(tǒng)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。進行光路流路的較準后再進行熒光補償，最后行樣本檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析 檢測結(jié)果以Mean±SD表示。利用SPSS 17.0分析試驗結(jié)果，采用獨立樣本t檢驗、配對t檢驗、卡方檢驗、生存分析等方法分析數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例資料分析結(jié)果 與健康對照組相比，肺癌患者淋巴細胞亞群除CD4+外的7項指標均有統(tǒng)計學差異，其中CD3+及CD8+明顯低于健康對照組，CD4+/CD8+比值、NK細胞、CD19+、CD25+及CD44+明顯高于健康對照組（表1）。與NSCLC相比，SCLC的CD8+明顯升高而CD4+和CD4+/CD8+比值明顯下降（P＜0.05）。NSCLC中I/II期與III/IV期相比、肺癌患者低/未分化與中/高分化相比，淋巴細胞亞群的8項指標均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表2）。

2.2 化療相關的隨訪資料分析結(jié)果 化療前后相比，肺癌患者淋巴細胞亞群中CD3+、CD19+、CD44+及NK細胞這4項指標具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其中化療后CD3+明顯上升，NK細胞、CD19+及CD44+明顯下降（表3）。化療后CD44+升高組29人，未升高組49人，Kaplan-Meier分析提示化療后CD44+表達不升高者有生存優(yōu)勢（P=0.021），而其余3項指標與患者預期生存無關（P＞0.05）（表4，圖1）。化療后CD44+升高組（69.45±17.89）與未升高組（46.45±18.33）相比有統(tǒng)計學差異（P=0.01），但兩組的性別、年齡、吸煙史、飲酒史和家族史相比無統(tǒng)計學差異。COX回歸分析顯示化療后CD44+表達不升高者有獨立的生存優(yōu)勢（RR=1.863,95%CI: 1.063-3.261, P=0.03），其余3項指標與患者預期生存無關（P＞0.05）。

表 1 肺癌患者與健康人外周血淋巴細胞亞群的對比Tab 1 Contrast of lymphocyte subsets in peripheral blood between lung cancer patients and healthy control group

表 2 肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與臨床病理學特征的關系Tab 2 Relationship between lymphocyte subsets in peripheral blood and clinicopathologic

表 3 肺癌患者外周血淋巴細胞亞群在化療前后的對比（n=78）Tab 3 Contrast of lymphocyte subsets in peripheral blood between pre-chemotherapy and post-chemotherapy (n=78)

表 4 化療后上升組與未上升組的生存期對比Tab 4 Contrast of survival times between increase group and un-increase group after chemotherapy

圖 1 CD44+生存曲線顯示化療后CD44+表達未升高者有生存優(yōu)勢（P=0.021）Fig 1 Survival curve of CD44+ showed the patients with un-increase of CD44+ after chemotherapy had more survival opportunities (P=0.021)

3 討論

一般認為具有免疫功能的淋巴細胞大致可分為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。CD3+總T細胞分為CD4+輔助T細胞和CD8+細胞毒T細胞，B淋巴細胞的表面抗原有CD19和CD20，NK自然殺傷細胞的表面抗原包括CD16、CD56，調(diào)節(jié)性T細胞表面抗原有CD25（白介素2受體），而CD44為粘附分子。

3.1 肺癌外周血淋巴細胞亞群的變化 在正常機體內(nèi)，細胞免疫、體液免疫和固有免疫系統(tǒng)維持著相互間平衡的關系。腫瘤患者往往都伴有免疫功能的抑制或紊亂。許多研究[1-4]在腫瘤患者體內(nèi)觀察到CD8+、CD25+及NK細胞升高，CD4+、CD4+/CD8+比值及CD19+降低的現(xiàn)象，而本研究卻發(fā)現(xiàn)CD8+下降，CD4+/CD8+比值、CD25+、NK細胞和CD19+上升。CD8+T細胞被公認為是抗腫瘤的主要效應細胞，而CD4+T細胞則被認為與機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫有關。肺癌患者外周血中觀察到CD8+T細胞下降的現(xiàn)象，可能是由于腫瘤細胞在特有的免疫逃逸機制作用下，改變了其表面特異性受體的結(jié)構(gòu)，使效應性T細胞無法正確識別和結(jié)合其靶點，導致細胞毒性T細胞的增殖被反饋性抑制。而此時非特異性免疫和體液免疫所占的比例相對上升，因此NK細胞和CD19+細胞升高。CD4+T細胞較健康組雖然有所下降，但無統(tǒng)計學意義，故CD4+/CD8+比值相應升高。

筆者認為腫瘤患者體內(nèi)淋巴細胞亞群的比例并非一成不變。Osada等[5]曾報道過胃癌患者外周血中CD4+細胞和CD8+細胞均下降的現(xiàn)象。而Patel等[6]總結(jié)人類乳頭瘤病毒的免疫逃避機制時提出CD4+細胞在早期的宮頸上皮內(nèi)瘤變中占主要地位，CD8+細胞在進展期宮頸癌中占主要地位。可見在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，隨著免疫微環(huán)境的改變，各淋巴細胞亞群的比例也會隨之變化，需多因子聯(lián)合檢測才能完整反映機體的免疫狀態(tài)。

本研究還比較了不同分期、不同分化程度肺癌外周血淋巴細胞亞群，發(fā)現(xiàn)上述8項指標均無統(tǒng)計學差異。NSCLC和SCLC相比CD8+、CD4+和CD4+/CD8+比值存在統(tǒng)計學差異。王亞娟等[7]曾報道CD4+及CD4+/CD8+比值在肺鱗癌和未分化癌間存在差異，而其它指標與分期及病理類型無相關性。這一結(jié)果與本研究結(jié)果基本相符。3.2 肺癌外周血淋巴細胞亞群與化療及預后的關系 傳統(tǒng)觀念認為腫瘤免疫以細胞免疫為主，體液免疫和固有免疫為輔。本研究證明化療后代表細胞免疫的CD3+T細胞升高，而代表體液免疫和固有免疫的CD19+細胞、NK細胞降低。該結(jié)果需要從兩方面考慮，一方面可能提示化療對機體免疫系統(tǒng)具有優(yōu)化作用，能活化抗腫瘤免疫應答，增強機體的抗腫瘤反應，誘使機體免疫應答朝向正向發(fā)展；另一方面化療藥物的非選擇性殺傷作用，對增殖活躍的淋巴細胞也有影響[2]。我們采用的檢測方法僅能得到各淋巴細胞的相對比例，并不能分析其絕對值，因此也可能是化療對體液免疫和固有免疫系統(tǒng)的損傷作用超過了細胞免疫，使CD3+總T細胞的比例相對升高。可見，目前的檢測方法并不能很好地評價化療對腫瘤免疫的影響，尚待深入研究。

CD44是一種分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，屬于細胞黏附分子。其正常功能是參與淋巴細胞的激活，介導淋巴細胞的歸巢、淋巴細胞向炎癥部位和黏膜相關淋巴組織歸位、黏附細胞外基質(zhì)等。近年來發(fā)現(xiàn)，CD44分子在許多惡性腫瘤組織中高表達[8,9]，但在外周血中的表達卻并非完全一致[10,11]，這可能與不同種類腫瘤的侵襲性不同有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血中CD44+的表達較健康人明顯升高，而化療后下降，并且在對化療相關的淋巴細胞亞群的生存分析結(jié)果提示化療后CD44+表達不升高者有生存優(yōu)勢（P=0.021），而其他3項指標則無統(tǒng)計學意義，并且此作用與患者性別、年齡、生活習慣（抽煙及飲酒史）等因素無關。以上證據(jù)提示CD44+是肺癌的危險因素之一，其升高可能與治療后預后不良有關，Lin等[12]在頭頸部腫瘤研究中也有類似報道。

抗腫瘤免疫是整個免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用，各種免疫細胞會隨著免疫狀態(tài)的改變而發(fā)生變化，聯(lián)合多因子檢測才能較完整的反映機體的免疫狀態(tài)。化療在殺傷腫瘤細胞的同時也引起免疫系統(tǒng)的改變，對于這種改變的評價還需進一步探討。同時，本研究發(fā)現(xiàn)CD44粘附分子在化療后的改變與生存時間有關，有望為臨床診療提供一些幫助。