非小細胞肺癌中MTAP蛋白及基因表達水平的檢測

李莎莎 張義軍 李洪利 丁保清

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在肺癌中常見，占其總數的80%-85%，主要包括鱗癌（squamous cell carcinoma, SCC）、腺癌（adeno carcinoma,AC）和大細胞癌（large cell cancer, LCC）3種亞型。隨著近10年來在腫瘤診斷、手術、放化療等方面的研究取得的一些進步，乳腺癌、前列腺癌等患者的5年生存率得到明顯提高，但NSCLC患者的5年生存率仍較低，在發展中國家不足9%。

甲硫腺苷磷酸化酶（methylthioadenosine phosphorylase, MTAP）是嘌呤和甲硫氨酸合成補救途徑中的一個關鍵酶，催化MTA生成ATP、dAMP和甲硫氨酸，參與細胞的能量合成與蛋白合成。MTAP在正常細胞和組織中表達豐富，但在多種惡性細胞系和腫瘤組織中都存在高頻缺失或降低。有文獻[1]報道，MTAP在NSCLC中存在純合性缺失。本研究通過檢測NSCLC組織、癌旁組織、邊緣肺組織中MTAP的表達水平，結合臨床資料探討NSCLC中MTAP的表達變化及與其臨床病理特征的關系，并為NSCLC的臨床診斷、治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本 原發NSCLC患者52例，2008年1月-2009年12月于濰坊市人民醫院和濰坊醫學院附屬醫院行外科手術治療，收集手術時切下的新鮮標本。根據所取組織分為NSCLC組、癌旁組（距癌邊緣2 cm）、邊緣組（距癌邊緣5 cm以上的邊緣肺組織），手術切除的新鮮組織以凍存管分裝后立即置入液氮罐中，后轉入-70oC冰箱保存。其中男性39例，女性13例；年齡43歲-72歲，中位年齡60.8歲；有吸煙史者38例，無吸煙史者14例；鱗癌28例，腺癌24例；高-中分化40例，低分化12例。所有病例術前均未采取放療、化療和免疫治療。患者均知情同意。

1.1.2 主要試劑 Trizol? Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Invitrogen公司；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物有限公司；兔抗人MTAP多克隆抗體購自武漢三鷹生物有限公司；SP免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測MTAP的表達 所有組織經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，每個蠟塊行5 μm厚連續切片，HE染色。觀察組織病理結構，由病理科醫師做出診斷，且癌旁組未見癌細胞。應用免疫組化SP法染色：以PBS代替一抗為陰性空白對照，已知結腸癌陽性切片為陽性對照；切片組織常規脫蠟入水后，微波抗原修復10 min，一抗孵育4oC過夜，DAB顯色5 min，蘇木素復染。

1.2.2 圖像分析 在顯微鏡相同光強度下，數碼相機關掉自動白平衡等功能，拍攝圖片（×200）。每例組織切片隨機采取5個視野，應用Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）專業圖像分析軟件對所采集的圖片進行圖像分析，選取AOI計算平均光密度（mean optical density, MOD）值，并在同一參數條件下對所有圖片進行MOD值分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測MTAP mRNA Trizol試劑盒提取NSCLC組織、癌旁組織以及邊緣肺組織中的總RNA，逆轉錄合成cDNA。根據Gene Bank中MTAP的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0引物設計軟件，設計引物序列，實時熒光定量PCR檢測樣本中MTAP cDNA水平，β-actin基因做內對照。引物：MTAP（292 bp）：上游引物5'-CGCTTGGTTCCCTTAGTC-3'，下游引物5'-GATGTTCGCCTGGTAGTT-3'；β-actin（314 bp）：上游引物5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'；下游引物5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。反應在25 μL的體系中進行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5 μL、10 μM的上下游引物各1 μL、樣本cDNA 2 μL （300 ng）、RNA酶滅活水8.5 μL。熱循環如下：94oC、5 min；94oC、30 s，57oC、30 s，72oC、60 s，40個循環；72oC、10 min。應用2-ΔΔCt法[2]分析目的基因和內參基因的Ct值，計算NSCLC組織和癌旁組織中MTAP mRNA相對于邊緣肺組織的表達差異。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件分析數據，結果用Mean±SD表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織、癌旁組織、邊緣肺組織中MTAP的免疫組織化學檢測 各組肺組織切片MTAP蛋白免疫組織化學染色（圖1）胞漿著色，呈棕黃色或黃褐色顆粒狀。52例NSCLC組織中有3例MTAP陰性，49例MTAP陽性，陰性率為（5.8%），而在癌旁組織、邊緣肺組織中均有表達。圖像MOD值分析顯示，NSCLC組MTAP蛋白含量為0.275±0.142，癌旁組為0.495±0.059，邊緣組為0.501±0.028。統計學分析顯示NSCLC組的MTAP蛋白表達水平明顯低于癌旁組和邊緣組（t分別為10.283、10.940，均P＜0.001），而癌旁組與邊緣組之間無明顯差異（t=0.694,P=0.491）。MTAP蛋白的表達與性別、年齡、吸煙史以及腫瘤的病理類型無明顯相關，但與腫瘤的分化程度有關（t=2.310, P=0.025）（表1）。

2.2 NSCLC組織、癌旁組織、邊緣組織中MTAP mRNA的表達 52例NSCLC組織、癌旁組織、邊緣肺組織中均有表達（圖2），以邊緣組作為對照組，MTAP mRNA相對表達量用以下公式計算：folds＝2-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝（CtMTAP-Ctβ-actin）樣品組-（CtMTAP-Ctβ-actin）對照組，通過計算得出NSCLC組織相對于邊緣肺組織的表達量為0.029±0.016；癌旁組織相對于邊緣肺組織的表達量為0.117±0.060，統計學分析顯示NSCLC組織中MTAP mRNA相對表達量明顯低于癌旁組織（t=9.902, P＜0.001）。

圖1 各組肺組織MTAP蛋白表達的免疫組化染色結果（×200）。A、B：NSCLC組織中（鱗癌、腺癌）MTAP的陽性表達；C：NSCLC組織中MTAP的陰性表達；D：癌旁組織中MTAP的陽性表達；E：邊緣肺組織中MTAP的陽性表達。Fig 1 Immunohistochemical staining results for MTAP in lung tissue (×200). A: Positive expressions of MTAP in squamous cell carcinoma; B: Positive expressions of MTAP in ademo carcinoma; C: Negative expression of MTAP in NSCLC tissue; D: Positive expression of MTAP in paracarcinomous tissue; E: Positive expression of MTAP borderline lung normal tissue.

表1 MTAP在NSCLC組織中的表達與患者臨床病理特征的關系（Mean±SD）Tab 1 The relationship between expression of MTAP and clinicopathological variables in NSCLC tissue (Mean±SD)

3 討論

MTAP基因定位于9p21，與CDKN2A、CDKN2B以及ARF臨近，該區域基因的缺失或超甲基化可導致基因表達的缺失。在惡性黑色素瘤[3]、蕈樣肉芽腫病[4]、腹膜間皮瘤[5]等發現，9p21的大片區域純合性缺失導致CDKN2A、ARF、MTAP失活，該部位的缺失與腫瘤的預后密切相關[4]，并且CDKN2A、ARF參與細胞周期的調控[6]。但對于淋巴瘤的研究[7]發現MTAP是一種獨立于CDKN2A、ARF的抑癌基因。

圖2 各組組織中MTAP基因PCR產物電泳圖。M：DNA marker（DL 2000）；第1-5泳道：MTAP mRNA的表達；第6-10泳道：β-actin mRNA的表達；第1、2、6、7泳道：邊緣正常組織；第3、4、8、9泳道：癌旁組織；第5、10泳道：NSCLC組織。Fig 2 PCR analysis of MTAP mRNA in NSCLC tissue. Lane M: DNA marker (DL 2000); Lane 1-5: Expression of MTAP mRNA; Lane 6-10: Expressions of β-actin mRNA; Lane 1, 2, 6, 7: borderline normal tissue; Lane 3, 4, 8, 9: paracarcinomous tissue; Lane 5, 10: NSCLC tissue.

MTAP在多胺代謝以及腺嘌呤、甲硫氨酸的合成補救過程中發揮重要作用。MTAP催化MTA轉化為腺嘌呤、MTR1P，并最終生成AMP、甲硫氨酸。在MTAP陰性的腫瘤細胞中，嘌呤合成主要依靠從頭合成途徑。在體外研究中，Krasinskas等[8]發現5'-脫氧-5'-甲硫腺苷與腺嘌呤類似物聯合療法可以殺死MTAP陰性的A549肺癌細胞，而對MTAP陽性的人成纖維細胞無作用。這提示MTAP可以用于肺癌的選擇性化療。MTAP的底物MTA是氨丙基轉移酶、甲基轉移酶的有效抑制劑[9]。Steven等[10]研究發現，MTAP基因缺失的黑色素瘤細胞內出現MTA四倍濃度的積聚，MTA介導成纖維細胞分泌基本的成纖維細胞生長因子（basis fi broblast growth factor, bFGF）和基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3, MMP3），并與黑素瘤細胞、成纖維細胞中轉錄激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）活性上調有關，MTA誘導腫瘤細胞侵襲力增強。通過比較基因組雜交[11]發現，156例胃腸道間質瘤中有25例出現MTAP純合性缺失，并且這種缺失與腫瘤的大小、有絲分裂速度、Ki-67指數、危險水平均呈正相關。MTAP的這些生物學特點提示其可能參與細胞的增殖和分裂以及腫瘤的侵潤、轉移等，因此被認為是腫瘤診斷和治療的新的分子靶點。本研究取材于NSCLC組織、癌旁組織以及邊緣肺組織，以研究MTAP基因在NSCLC不同發展階段的表達情況及其相關性。免疫組化結果顯示，MTAP在NSCLC組織、癌旁組織以及邊緣肺組織中均有表達，但在NSCLC組織中的表達量明顯低于癌旁組織以及邊緣肺組織，說明MTAP通過改變腫瘤細胞的生長代謝參與了NSCLC的發生發展過程。

以往研究[12]表示，卵巢癌組織Western印跡檢測到的MTAP蛋白缺失率高于RT-PCR檢測到的MTAP mRNA的缺失率。本研究發現，通過免疫組織化學檢測有3例NSCLC組織出現MTAP蛋白缺失，而PCR檢測未發現MTAP mRNA的缺失，這種蛋白水平與基因水平檢測結果的不同有異于以往研究結果[13]。其原因可能是，DNA甲基化程度改變導致的基因漸生性沉默、組蛋白尾部的共價修飾以及染色質變性，microDNA這些因素導致了實時定量PCR檢測實體瘤中MTAP缺失的局限性[14]，這些發現表示，在診斷NSCLC患者的MTAP表達缺失時，免疫組織化學優于PCR。本研究通過免疫組織化學染色方法檢測到，在高-中分化的NSCLC組織中MTAP蛋白表達顯著下調，說明MTAP不但與NSCLC的發生發展有關，而且與腫瘤的惡性程度有關。在mRNA水平，NSCLC組織中MTAP基因相對表達量明顯低于癌旁組織，表明在NSCLC發展過程中存在MTAP基因在轉錄水平的下調。MTAP蛋白的表達與患者性別、年齡、吸煙史以及腫瘤的病理類型無明顯相關，這也可能與樣本量有限相關，還需進一步加大樣本量驗證MTAP在轉錄和翻譯水平的表達差異。