原發性非小細胞肺癌中線粒體DNA含量變化的研究

王紅梅 戴紀剛

線粒體是真核細胞的重要細胞器，作為細胞的“動力工廠”，它在細胞的能量代謝和氧自由基生成過程中扮演重要角色。同時，線粒體也是細胞凋亡調控的關鍵元件，這些細胞器收集并處理有關細胞代謝和信號轉導級聯各方面的信號，決定著細胞的命運，參與了細胞死亡的執行過程。能量代謝模式的轉換是癌細胞的重要特征。細胞在癌變過程中，將線粒體關閉，能量來源轉換為糖原酵解模式，同時線粒體啟動異常細胞凋亡的作用消失，這些細胞就可能“永生化”及癌變。線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）含量（即拷貝數）及氧化磷酸化相關酶活性的降低是腫瘤能量代謝發生改變的主要原因。為了解非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織中mtDNA的拷貝數是否發生改變并探討mtDNA拷貝數改變與NSCLC的相關性，本研究通過兩個單獨的實時熒光定量PCR對肺癌及相對應的癌旁組織mtDNA的含量進行了精確定量（拷貝數/細胞）。

1 材料與方法

1.1 病例資料 所用37例肺癌組織和37例癌旁肺組織均取自第三軍醫大學附屬新橋醫院2006年-2008年外科手術患者，均經病理確診。癌旁肺組織標本為同一患者病灶遠端5 cm以上的正常肺組織，均經組織學診斷，證實其沒有癌細胞。本組患者男性28例，女性9例，吸煙及曾經吸煙者24例（吸煙者：每天吸煙10支以上且吸煙時間超過1年。本組中包括曾經吸煙而現戒煙1年以上者9例），不吸煙者13例。患者年齡30歲-75歲，中位年齡為55歲。組織學病理分型情況為：鱗癌23例，腺癌14例。

1.2 組織全基因組DNA提取 采用酚、氯仿、異戊醇抽提法提取全基因組DNA（包括mtDNA）。所得DNA溶于TE buffer（10 mM Tris±HCl, 1 mM EDTA, pH8.0），并用紫外分光光度計測定其波長260 nm時的吸光度（ OD260nm）值，計算DNA 濃度，-20oC保存備用。

1.3 PCR引物及TaqMan探針 所有引物由上海基康生物技術有限公司合成、標記。本實驗中應用的熒光檢測物質有FAM（6-Carboxy-fluorescein）和TAMRA（6-Carboxytetramethy-rhodamine），其中FAM作為報告基因（Reporter），標記在TaqMan探針的5'。TAMRA作為熄滅基因（Q uencdher），標記在TaqMan探針的3'。TaqMan探針與目的基因的結合部位在兩個引物之間。用于擴增人mtDNA D-loop HV1（Hipervariable region 1, HV1）和核β-globin基因的引物及TaqMan探針見表1。

1.4 線粒體HV1和核β-globin基因實時熒光定量PCR檢測

1.4.1 實時熒光定量PCR標準品的制備

1.4.1.1 HV1和β-globin基因片段的PCR擴增 PCR反應體系為25 μL，終濃度為：Taq酶2 U，MgCl22.5 mmol/L，dNTP各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，模板DNA約100 ng 。反應條件：94oC預變性5 min，其余40個循環94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、1 min，最后72oC延伸10 min。

1.4.1.2 PCR擴增產物的克隆 用TaKaRa公司的試劑盒對PCR樣品進行純化后，分別將128 bp HV1和110 bp β-globin擴增產物克隆至PMD18-T載體（TaKaRa公司），篩選含有插入片段的載體，以JM109感受態細胞進行轉化。用質粒提取試劑盒（QIAGEN公司）提取質粒。

1.4.1.3 質粒的鑒定與測序 將部分所提取的質粒經過PCR和序列測定進行鑒定，測序反應由上海基康生物技術有限公司完成 。

1.4.1.4 質粒濃度測定及拷貝數換算 紫外分光光度計檢測其OD260值。質粒濃度（ng/μL）=OD260×50 μg/mL×稀釋終體積（mL）×1,000/稀釋時加入的原始溶液體積（μL）。質粒拷貝數（Copies/μL）=質粒濃度（ng/μL）×6.02×1014/660×堿基數（載體+插入片段）。

1.4.1.5 標準品的梯度稀釋 以無菌去離子水10倍比梯度稀釋HV1和β-globin質粒分別獲得濃度為1×103-1×107拷貝/μL的制備定量PCR標準曲線的模板。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測

1.4.2.1 PCR反應 25 μL體系中含ABI TaqMan 1×PCR Master mix、3.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、引物各0.5 μmol/L、熒光探針50 nmol/L、模板各2.0 μL 。每次檢測設置3個NTC（no template control）。每個樣品進行3個平行樣實驗。

1.4.2.2 PCR反應條件 50oC、2 min，95oC、10 min；然后95oC、15 s，60oC、30 s，共50個循環。TaqMan PCR Core試劑盒、光學PCR管、7700型PCR儀均為PE公司產品。

1.4.2.3 HV1和β-globin標準曲線繪制 將不同梯度濃度的標準品，與待測樣品同時進行定量PCR擴增，繪制標準曲線。

1.4.2.4 mtDNA拷貝數的檢測 通過兩個單獨的實時熒光定量PCR分別對待測樣本中線粒體HV1和核β-globin基因進行定量。以mtDNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數的標記。mtDNA的含量，即相對拷貝數/二倍體核基因組（diploid nuclear genome）=2×HV1/β-globin[1]。

1.5 統計學方法 計量資料以Mean±SD表示，使用SPSS 11.0統計學分析軟件進行t檢驗和線性回歸分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 克隆質粒的鑒定 提取經篩選的用于制作標準曲線模板的質粒，經過PCR及序列測定證實，HV1和β-globin基因PCR片段已分別連接至PMD18-T載體上，并用所建立的實時熒光定量PCR檢測，可見有明顯的熒光信號。

2.2 標準曲線的制備 根據不同濃度的標準品測得的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（threshold cycle,Ct）值繪制標準曲線（圖1）。不同濃度標準定量的模板與Ct值呈直線相關。HV1和β-globin基因定量PCR標準曲線的相關系數分別為0.998和0.999，斜率分別為-3.159和-3.400。

2.3 肺癌mtDNA拷貝數的改變 為了解肺癌組織中mtDNA含量的改變，我們通過兩個單獨的實時熒光定量PCR，對肺癌及相對應的癌旁肺組織mtDNA含量進行了精確定量（拷貝數/細胞）。線性回歸分析表明，肺組織mtDNA拷貝數和相對應的正常肺組織mtDNA拷貝數之間有相關性（r=0.589, P＜0.01）（圖2）。肺癌組織mtDNA的平均拷貝數/細胞為395±125，而相對應的正常肺組織為733±196，前者明顯低于后者（P＜0.001）。

2.4 肺癌mtDNA拷貝數改變和臨床指標的相關性 根據患者性別、年齡、是否吸煙、病理類型，我們將37例樣本進行分組。統計結果顯示，肺癌mtDNA拷貝數的改變與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤的病理類型無關（P＞0.05）（表 2）。

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圖1 mtDNA HV1（圖1A，圖1B）和核基因（圖1C，圖1D）實時熒光定量PCR動力曲線圖和標準曲線Fig 1 Amplification plots and standard curves of real-time PCR for Mitochondrial DNA HV1 (Fig 1A,Fig 1B) and nuclear β-globin gene (Fig 1C, Fig 1D)

圖2 肺癌及相對應的癌旁肺組織mtDNA 拷貝數散點圖及線性相關分析Fig 2 MtDNA copy number in lung cancinoma and adjacent nomal samples

表2 肺癌線粒體DNA拷貝數的改變和臨床指標的關系Tab 2 MtDNA copy number per nucleus in relation to clinicopathological variables in lung cancer

3 討論

哺乳動物mtDNA是一全長為16.5 kb左右的雙鏈閉環分子。它含有37個基因和一個非編碼區（控制區），非編碼區又稱之為D環（displace loop, D-loop），其內有控制mtDNA轉錄和翻譯的調節序列。人類mtDNA D-loop的起始和結束位置分別為mtDNA的16,023和576核苷酸處，長度為1,122 bp。mtDNA兩條互補鏈的堿基組成呈非對稱性。一條鏈稱重鏈，富含G堿基，編碼37個線粒體基因中的28個。另一條鏈稱輕鏈，G堿基較少，編碼其余的線粒體基因。與核不同的是，線粒體基因組為多拷貝基因組。體細胞中平均含有100個-500個線粒體，而每一個線粒體中又含有1個-15個mtDNA分子。呼吸鏈的正常組合和運轉需要一個完整和功能性的線粒體基因組，而mtDNA功能的完成既依賴于每一個mtDNA分子結構的完整性，也同時依賴于細胞中mtDNA的拷貝數。

大多數實體性腫瘤中，能量代謝的改變和mtDNA含量有著密切的聯系。Meierhofer等[1]研究表明腎癌組織中mtDNA含量和酶活性顯著低于癌旁組織，并且兩者的下調呈一致性。Mambo等[2,3]發現80%的乳腺癌組織其mtDNA拷貝數低于相應的正常組織。研究[4]表明線粒體酶活性的降低與腫瘤的類型和分化程度密切相關。目前還在肝癌、結腸癌等多種腫瘤及腫瘤細胞株中發現存在有mtDNA含量的降低[5]。在本研究中，我們對NSCLC及相對應的癌旁正常肺組織mtDNA拷貝數進行了精確定量（拷貝數/細胞），結果發現，肺癌組織mtDNA的平均拷貝數/細胞低于相對應的癌旁正常肺組織。但我們并沒有觀察到mtDNA拷貝數的改變與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤的病理類型之間的相關性。由此我們可以推論，mtDNA拷貝數量的改變與NSCLC的發生有密切關系，與患者性別、年齡、是否吸煙等因素無關；但NSCLC與小細胞肺癌之間是否有差異性則無法判斷。這與Matthew等[6]的研究結果具有一致性。

研究表明腫瘤的發生與細胞凋亡異常密切相關，而線粒體途徑是介導細胞凋亡的經典途徑之一。一些環境因素的改變或者有害物質的入侵，可造成線粒體腫脹破裂或多個線粒體融合成一個大線粒體，影響呼吸鏈電子傳遞，造成細胞死亡。這些都表明線粒體在腫瘤的發生過程中具有重要作用。我們檢測到肺癌組織中mtDNA的含量低于癌旁正常組織，表明mtDNA拷貝數降低可能導致肺癌細胞凋亡減少，從而促進了肺癌的生長、浸潤和轉移。

由于腫瘤細胞線粒體在分子、生化、代謝和遺傳水平上明顯區別于正常細胞，惡性腫瘤組織氧化抑制抑制酵解的現象減弱甚至消失，而代之以酵解抑制氧化，此即Crabtree效應。我們實驗測得正常肺組織mtDNA平均拷貝數/細胞為733±196，低于骨骼肌細胞中的1,811±546[7]和心肌細胞中的6,970±920拷貝數/細胞[8]，這與肺組織細胞能量代謝和有氧ATP生產的需求低于骨骼肌和心肌細胞的特點是一致的。臨床研究調查表明肺腫瘤的發生率遠遠大于骨骼肌和心肌腫瘤的發病率。由此我們可以推論，mtDNA含量低的組織細胞更易適應糖酵解供能的生長模式，從而發生腫瘤的幾率更高。

研究[9]發現線粒體特異性的抑制劑處理和mtDNA的部分減損，可通過某個應激信號而誘導肺癌A549細胞系出現侵襲性腫瘤表型；mtDNA缺失細胞系HeLa rho0細胞對阿霉素和光動力性療法（photodynamic therapy）誘導的細胞死亡具有極端的耐受性，而HeLa rho+細胞卻非常敏感[10-12]；這表明mtDNA含量降低不僅與惡性腫瘤的發生和轉移有關，還關系到腫瘤的治療和預后，NSCLC中mtDNA含量較低可能是其化療敏感性差的原因之一。

目前我們的研究結果表明mtDNA含量降低可能與NSCLC的發生、轉移、治療和預后具有密切關系。但引起這一變化的原因和具體機制還不清楚。我們將進一步探索研究，以期能為NSCLC的治療提供更多理論基礎。