非小細胞肺癌組織中ZO-1的表達及其臨床意義

王曄愷 周吉航 曾芳 黃燕燕 周世權 劉曉光

緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1, ZO-1）是一種與緊密連接有關的蛋白，參與維持和調節上皮屏障功能，常作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標，如血腦屏障[1]、腸上皮細胞[2]等。為探討ZO-1與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）臨床及病理特性的關系，本研究通過實時熒光定量PCR、Western blot、免疫組化檢測101例NSCLC患者癌組織和癌旁組織的ZO-1 mRNA和蛋白表達，探討其與腫瘤分期、淋巴結轉移、預后等臨床指標的相關性。

1 材料與方法

1.1 對象 收集舟山醫院2006年1月-2008年2月101例NSCLC患者（包括腺癌41例，鱗癌43例，細支氣管肺泡癌17例）癌組織和癌旁組織（距離癌組織2 cm）標本，男性65例，女性36例，年齡（42-80）歲，平均年齡（61.20±8.51）歲。以61例肺部良性病變為對照（炎性假瘤33例，機化性肺炎18例，支氣管擴張8例，結核球1例，錯構瘤1例），男性40例，女性21例，年齡（41-82）歲，平均年齡（67.37±11.02）歲。診斷均經病理切片確認，置液氮罐中保存，取材為病理切片完成后所留組織，經舟山醫院倫理學委員會批準并征得患者同意。

1.2 儀器和試劑 兔抗人ZO-1一抗購自Zymed Labs（WB和IHC通用型），兔抗人GAPDH一抗購自Abcam，SP-9000免疫組化試劑盒購自中杉金橋，細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PVDF膜、HRP標記山羊抗兔二抗均購自碧云天，Trizol購自Invitrogen，pMD18載體試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（Syber Green I）購自Takara，熒光定量PCR引物（S: Sense; A: Antisense）：ZO-1-S：5'-GAGATGAACGGGCTACGC-3'，ZO-1-A：5'-GAGACTGCCA TTGCTTGG-3'，擴增產物230 bp；GAPDH-S：5'-GACCTGACCTGCCGTCTA-3'，GAPDH-A：5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'，擴增產物148 bp；均由上海生工合成，熒光PCR儀為Roche Lightcycle，圖像采集系統為Olypus-BX60，凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司Universal Hood II型，凝膠成像分析軟件為Quantity One，勻漿器為德國IKA T10 basic型。

1.3 ZO-1實時熒光定量PCR

1.3.1 ZO-1和GAPDH標準品構建 Trizol提取總RNA，鑒定完整性和純度，取5 μg總RNA冰上逆轉錄成cDNA進行逆轉錄PCR，反應體系25 μL：其中DNA模板3 μL，10 μmol/L ZO-1或GAPDH熒光定量PCR引物各1 μL，5×PCR緩沖液5 μL，加去RNA酶水補至25 μL，反應條件：95oC、5 min；94oC、30 s，53.7oC、30 s，72oC、1 min，30個循環；72oC、10 min。PCR反應產物經純化后，加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片段4.5 μL、pMD18-T載體0.5 μL，低速離心后于16oC連接過夜，將連接液轉化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板，挑取單菌落培養過夜，抽提其質粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測序確證。

1.3.2 實時熒光定量PCR 將重組質粒10倍4梯度稀釋做為標準品，對cDNA進行Syber Green I熒光染料嵌合法檢測，反應體系參照試劑說明書，反應條件：95oC、5 min；94oC、30 s，53.7oC、30 s，72oC、60 s，40個循環；72oC、10 min，利用各自的標準曲線分別對樣品中的目的基因和內參基因分別進行定量，肺組織中ZO-1 mRNA的相對表達量為ZO-1基因拷貝數/GAPDH基因拷貝數。

1.4 Western blot檢測ZO-1蛋白表達

1.4.1 肺組織蛋白提取 預冷PBS洗滌組織2次，將肺組織剪碎，勻漿，加入適量含PMSF的RAPI裂解液，冰上裂解30 min，4oC下12,000 rpm離心15 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度，分裝后-80oC保存。

1.4.2 Western blot 分別取總蛋白上清液24 μL，加6 μL 5×上樣緩沖液混勻。用普通PCR儀煮沸10 min變性后取30 μg上樣，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白（12%分離膠，5%濃縮膠），轉移至PVDF膜上（300 mA, 30 min），5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2 h，按照蛋白質Marker切割PVDF膜，并分別加入1:2,000稀釋的兔抗人ZO-1多克隆抗體和1:500稀釋的兔抗人GAPDH多克隆抗體，4oC過夜。PBS-T洗滌3次，每次10 min。再分別加入1:5,000稀釋的羊抗兔IgGHRP，室溫震搖1 h，PBS-T洗滌3次，每次15 min。ECL系統顯色，凝膠成像儀檢測，采用Quaintity One分析軟件進行條帶分子量及灰度值的分析。

1.5 ZO-1免疫組化 石蠟切片脫蠟水化后，PBS洗3遍，3%H2O2浸泡切片10 min封閉內源性過氧化物酶，微波熱處理（98oC, 10 min）修復抗原，切片置于濕盒中，小牛血清常溫孵育1 h封閉非特異性抗原，吸取封閉液，加兔抗人ZO-1一抗（1:100稀釋），4oC孵育過夜，孵育結束后吸去一抗，PBS-T洗片3次，加人HRP標記山羊抗兔二抗（1:200稀釋），室溫下孵育30 min，孵育結束后吸去二抗，PBS-T洗片3次，滴加DAB顯色3 min-5 min，自來水沖洗切片終止反應，蘇木素復染30 s，常規脫水、封片放干過夜，棕褐色為陽性著色。以PBS代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下攝片，用Imagepro-Plus 6.0進行積分光密度值（integral optical density, IOD）測定并計算平均光密度（average of the optical densities, AOD），選定組織區域，通過AOD測定ZO-1蛋白的表達，其值越大，表達量越高。

1.6 生存隨訪 2年后采用記錄在案的電話隨訪101例肺癌患者本人或家屬，有6例失訪，在訪的95例患者中44例死于肺癌復發或遠端轉移引起的疾病，未有非正常死亡。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件，用t檢驗單因素方差分析進行數據分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者癌組織、癌旁組織和肺良性病變肺組織中ZO-1 mRNA和蛋白 ZO-1 mRNA在癌組織、癌旁組織、肺良性病變肺組織中的相對表達量分別為0.99±0.47、1.10±0.55、1.24±0.39，肺癌組織與肺良性病變肺組織之間比較具有顯著性差異（P＜0.01）。ZO-1蛋白在癌組織、癌旁組織、對照組中的相對表達量分別為0.45±0.31、0.75±0.26、0.87±0.39，癌組織和對照組之間、癌組織和癌旁組織之間的差異均具有統計學意義（P＜0.01），癌旁組織和對照組之間的差異亦具有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 NSCLC患者癌組織和癌旁組織不同臨床及病理因素中ZO-1 mRNA的表達 癌旁組織ZO-1 mRNA在淋巴結轉移組和淋巴結未轉移組中的差異具有統計學意義（t=-5.07,P＜0.01），2年生存組和2年死亡組中的差異具有統計學意義（t=5.61,P＜0.01）；癌組織中ZO-1 mRNA在2年生存組和2年死亡組的差異存在明顯差異（t=3.81,P＜0.01）（表1）。

2.3 ZO-1蛋白在NSCLC患者肺組織中的免疫組化結果 在癌旁（圖中為腺癌癌旁）和對照組織中，ZO-1沿著肺泡壁均勻分布；在癌組織中（圖中為腺癌組織），ZO-1也沿著腺泡壁分布，但不完整，存在部分位置的缺失，腺癌細胞間的ZO-1呈低表達。ZO-1平均光密度在癌組織、癌旁組織和對照組中分別為69.55±17.13、246.39±83.15、330.93±72.44，組之間差異均具有統計學意義（P＜0.01）（圖2）。

3 討論

ZO-1屬于膜鳥苷酸激酶MAGUK（membranceassociate guanylate kinase homologs, MAGUK）家族[3]，與ZO-2、ZO-3組成ZO-1/ZO-2/ZO-3復合體，該復合體有3個PDZ區，ZO-1通過其PDZ區與其它細胞連接蛋白如肌動蛋白[4]等相互連接。本研究通過將ZO-1和GAPDH構建到T載體作為標準品，利用Syber Green I熒光染料嵌合法檢測ZO-1和GAPDH mRNA的相對表達含量，通過檢測顯示癌組織中的ZO-1 mRNA和蛋白均低于對照組（P＜0.01）。由于ZO-1具有正常上皮細胞標志物的特性[5]，因此其mRNA的降低可能是肺癌早期發生的指標之一，這點在其它多種癌組織中已有報道： Fiorini等[6]發現化學藥物DDT作用于ZO-1等影響到細胞耦合損傷，并推測可能在癌變中起作用；Orban等[7]通過RT-PCR發現原發性肝癌中出現ZO-1 mRNA相對于正常肝的表達降低。可見，ZO-1除了粘附和屏蔽功能外，還參與細胞耦合功能構建，其參與構建的緊密連接束（tight junction srtands, TJs）對上皮屏障功能有重要影響[8]。目前有報道證實，多種物質如糖原合酶激酶-3[9]、胰島素樣生長因子[10]等可通過作用于ZO-1影響TJs的構建或屏障功能。從免疫組化的結果來看，癌細胞間的ZO-1表達大量缺失，可能影響到癌組織中TJs的構建，使得肺部微環境有利于腫瘤細胞的原位增殖。

表1 NSCLC患者癌組織和癌旁組織不同臨床及病理因素中的ZO-1 mRNA的表達Tab 1 Expression of ZO-1 mRNA in different clinicopathologic parameters and the survial rates in carcinoma tissue and adjacent tissue of the patients with NSCLC

圖1 肺癌患者癌組織、癌旁組織和對照組中ZO-1蛋白表達。A：Wester blot檢測ZO-1表達；B：柱狀分析圖表明ZO-1表達在癌組織、癌旁組織和對照組中的差異存在明顯差異；泳道1-2： 癌旁組織；泳道3-4：對照組；泳道5-6：癌組織；*：與對照組相比，P＜0.05；**：與對照組相比，P＜0.01；##：與癌旁組相比，P＜0.01。Fig 1 Expression of ZO-1 protein in carcinoma tissue group, adjacent tissue group and control group. A: Expression of ZO-1 protein determined by Western blot; B: The densitometric analysis reveal that the levels of ZO-1 protein among the carcinoma tissue group, the adjacent tissue group and the control group were with significantly statistic difference; Lane 1-2:adjacent tissue group; Lane 3-4: control group; Lane 5-6: carcinoma tissue group; *: compared with the control group, P＜0.05; **: compared with the control group, P＜0.01; ##: compared with the adjacent tissue group, P＜0.01.

圖2 NSCLC患者肺組織中ZO-1免疫組化。A：ZO-1在肺組織中的免疫組化（SP，×20）；B：柱狀分析圖表明ZO-1表達在癌組織、癌旁組織和對照組中的差異存在顯著統計學意義；**：與對照組相比，P＜0.01；##：與癌旁組相比，P＜0.01。Fig 2 Immunohistochemical assessmen of ZO-1 in lung tissue of patients with NSCLC. A: Immunohistochemical assessmen of ZO-1 in lung tissue(SP, ×20). In adjacent tissue of gland cancer and control group, ZO-1 distributed through the alveolar walls completely. But in carcinoma tissue of gland cancer, ZO-1 distributed through the alveolar walls incompletely; there is a low expression of ZO-1 between the gland cancer cells; B: The densitometric analysis reveal that the averages of the optical densities of ZO-1 protein among the carcinoma tissue group, the adjacent tissue group and the control group were significant statistic different; **: compared with the control group, P＜0.01; ##: compared with the adjacent tissue group, P＜0.01.

本研究還發現，在NSCLC癌組織中淋巴結遠端轉移和未轉移組中的ZO-1 mRNA未存在明顯差異（P＞0.05），但兩者在癌旁組織中卻存在明顯差異（P＜0.01），這可能是由于ZO-1主要表達于胞膜和細胞間質[11]，而肺組織淋巴系統內皮細胞間連接是由ZO-1等一系列緊密連接蛋白構建，ZO-1的低表達降低了周圍微循環組織內皮細胞的緊密連接性，影響其柵欄屏障功能和免疫細胞的分布[12]，從而更有利于癌細胞通過通透性增高的組織擴散進入淋巴系統[13]。Tuomi等[14]發現蛋白激酶Cepsilon調控alpha 5-ZO-1復合體控制肺癌細胞遷移片層的形成。Zen等[15]發現在食管鱗癌患者組織中PARD3基因的低表達可干擾ZO-1的胞間位置，并和淋巴結轉移存在相關性。Ohtani等[16]在胃癌中發現緊密連接蛋白Claudin-4、ZO-1與腫瘤侵襲性存在相關性。但是癌組織中ZO-1 mRNA在是否侵犯胸膜組別中卻無明顯差異，這可能是癌細胞在肺組織內擴散和淋巴轉移略有不同，實體組織內腫瘤擴散不但和腫瘤侵襲性及肺內部微環境等有關，還和癌組織原發部位及病程長短有關。癌組織中ZO-1 mRNA在2年內死亡組和2年生存組中的差異具有統計學意義（P＜0.01），且癌旁組織中也存在顯著統計學意義（P＜0.01），這意味著癌組織和癌旁組織中ZO-1 mRNA可能是一個和MA-15-5抗原[17]類似并與NSCLC 2年生存率密切相關的指標，但是否能作為臨床預后的決定性因素，還需要進一步研究。