晚期肺腺癌患者化療前后血清EGFR基因突變狀態的比較

韓如冰 鐘巍 趙靜 張力 夏瑩 王寒 李龍蕓 王孟昭

越來越多的證據表明非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突變狀態影響NSCLC的治療策略。近90%的EGFR基因突變集中于外顯子19的缺失突變和外顯子21點突變[1,2]。對于EGFR基因突變陽性的NSCLC患者，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI），包括吉非替尼和厄洛替尼，有明顯療效。然而我們應注意到，對于最初EGFR基因突變陽性的人群，EGFR-TKIs作為二/三線治療和一線治療的客觀有效率是有差異的，分別為30%-40%[3-5]和70%[6-8]。因此我們推測化療會對EGFR基因突變狀態產生影響，從而影響EGFR-TKIs作為NSCLC二/三線治療的有效率。

然而化療前后分別取肺癌組織標本進行EGFR基因突變檢測臨床實踐困難。研究[9]表明，實體腫瘤形成和發展過程中常有少量的腫瘤細胞從原發腫瘤脫落進入血循環，此類癌細胞在血循環中凋亡并將遺傳物質釋放到血液中，這提示血液游離DNA可成為檢測腫瘤基因突變的一種方法，而且標本獲得更加方便。幾項較大樣本的研究[10,11]均發現晚期肺癌患者血清和腫瘤組織EGFR基因突變狀態檢測的一致性為79.7%-94%，這些研究提示血清DNA可替代腫瘤組織DNA進行腫瘤EGFR基因突變檢測。本研究收集晚期肺腺癌患者化療前后的配對血清標本，使用酶切突變富集巢式PCR法直接測序進行EGFR基因突變檢測，觀察化療對EGFR基因突變狀態是否存在影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2009年11月-2010年5月就診于北京協和醫院呼吸內科肺癌中心的患者血清標本。患者入選標準包括：組織學和/或細胞學證實的肺腺癌患者，分期為IIIb期或IV期，有全身化療前和化療2個-6個周期后的配對標本。每次收集全血標本2 mL，分離血清，-20oC保存。共收集化療前后配對標本33例。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法 采用磁珠法提取200 μL血清中游離DNA（磁珠法游離DNA提取試劑盒，北京金麥格生物技術有限公司），獲得游離DNA 30 μL，測得平均DNA濃度為7.3 ng/μL（2.7 ng/μL-17.4 ng/μL），置于1.5 mL離心管中凍存備用。

EGFR基因外顯子19和21的擴增采用酶切突變富集巢式PCR法。引物的序列見表1（上海Invitrogen公司合成）。第一輪PCR反應體系為10 μL，包括GoTaq mix 5 μL、上下游引物（10 pm/μL）各0.5 μL、基因組DNA 3 μL，無核酸水補齊至10 μL。反應條件為95oC、5 min；95oC、30 s，56oC、30 s，72oC、50 s，5個循環；95oC、3 s，61oC、30 s，72oC、50 s，15個循環；72oC、10 min。

酶切反應體系及條件：體系20 μL，包括PCR1產物1 μL、限制性內切酶Mse I 0.5 μL（外顯子19）或限制性內切酶Msc I 0.5 μL（外顯子21）、10×buffer 1 μL，無核酸水補齊至20 μL；反應條件為37oC、5 h。

第二輪PCR反應體系為25 μL，包括GoTaq mix 12.5 μL、上下游引物（10 pm/μL）各1.5 μL、模板DNA（即PCR1產物酶切后的DNA）1 μL，無核酸水補齊至25 μL。外顯子19反應條件為95oC、5 min；95oC、30 s，55oC、30 s，72oC、30 s，40個循環；72oC、10 min。外顯子21反應條件為95oC、5 min；95oC、30 s，58oC、30 s，72oC、30 s，40個循環；72oC、10 min。

1.3 EGFR基因外顯子19和21突變狀態判斷 最終PCR產物由上海Invitrogen公司完成測序，使用DNAMAN軟件閱讀序列。EGFR基因外顯子19突變為缺失突變，巢式PCR擴增產物序列測序結果與野生序列進行比對，若與野生型序列吻合，判讀為野生型；若為單一序列且其序列表現為一段堿基缺失時，判讀為突變型；若為野生型序列和突變型序列的疊加，也判讀為突變型（圖1）。EGFR基因外顯子21突變為L858R點突變，巢式PCR擴增產物序列測序結果與野生序列進行比對，若與野生型序列吻合，判讀為野生型；若為單一序列且其序列表現為突變型堿基G時，判讀為突變型；若為野生型序列和突變型序列的疊加，即野生型堿基T和突變型堿基G混合，也判讀為突變型（圖2）。EGFR基因敏感突變包括外顯子19的缺失突變和/或外顯子的21點突變。

1.4 統計學分析 使用SPSS 16.0軟件進行統計分析，使用χ2檢驗分析不同亞組患者EGFR基因突變率的差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的一般情況 入組33例患者中男性20例，女性13例；年齡36歲-75歲，中位年齡57歲；吸煙者11例，不吸煙者22例。其中29例接受一線化療，方案包括吉西他濱聯合鉑類13例，紫杉醇聯合鉑類10例，培美曲塞聯合順鉑5例，VP-16聯合順鉑1例；4例接受二線單藥多西紫杉醇化療。化療療效：部分緩解（partial response,PR）5例，疾病穩定（stable disease, SD）22例，疾病進展（progresive disease, PD）6例。

2.2 化療前血清EGFR基因突變狀態 化療前血清DNA樣本檢測結果顯示患者EGFR基因突變發生率為39.4%（13/33）。外顯子19突變8個，突變率為24.2%（8/33），外顯子21突變11個，突變率為33.3%（11/33），可見以外顯子21突變為主（57.9%, 11/19），其中6例患者同時伴有外顯子19和21突變。女性患者EGFR基因突變率為46.2%（6/13），男性患者突變率為35.0%（7/20），女性高于男性，但無統計學差異（P=0.52）。吸煙患者突變率為45.5%（5/11），不吸煙患者突變率為36.4%（8/22），吸煙患者略高于不吸煙患者，但無統計學差異（P=0.61）。

表1 EGFR基因外顯子19和21巢式PCR擴增引物序列Tab 1 Primer sequences used for nested PCR of exon 19 and 21 of EGFR gene

圖1 EGFR外顯子19 PCR2產物直接測序圖。A：野生型序列；B：混合型序列；C：突變型序列。Fig 1 Direct sequencing of PCR2 products for exon 19 of EGFR gene. A: wild type; B: mixture of both wild and mutant type; C: mutant type.

圖2 EGFR外顯子21 PCR產物直接測序圖。A：野生型序列；B：混合型序列；C：突變型序列。Fig 2 Direct sequencing of PCR products for exon 21 of EGFR gene. A: wild type; B: mixture of both wild and mutant type; C: mutant type.

2.3 化療后血清EGFR基因突變狀態 化療后血清DNA樣本檢測結果顯示患者EGFR基因突變發生率為54.5%（18/33）。外顯子19突變10個，突變率為30.3%（10/33），外顯子21突變14個，突變率42.4%（14/33），可見以外顯子21突變為主（58.3%, 14/24），其中6例患者同時伴有外顯子19和21突變。女性患者EGFR基因突變率為38.5%（5/13），男性患者突變率為65.0%（13/20），女性低于男性，但無統計學差異（P=0.14）。吸煙患者突變率為72.8%（8/11），不吸煙患者突變率為45.5%（10/22），吸煙患者高于不吸煙患者，但無統計學差異（P=0.14）。

2.4 化療前后的比較 化療前患者檢出EGFR基因敏感突變陽性率為39.4%（13/33），化療后患者檢出EGFR基因敏感突變陽性率為54.5%（18/33），無統計學差異（P=0.51）。患者化療前后EGFR基因敏感突變狀態一致率為54.5%（18/33），患者化療前后EGFR基因敏感突變具體變化見表2。

對于EGFR外顯子19缺失突變，化療前陽性率為24.2%（8/33），化療后陽性率為30.3%（10/33），無統計學差異（P=0.16），其中化療前后均陽性4例，化療前后均陰性19例患者，化療前陰性化療后陽性6例，化療前陽性化療后陰性4例。對于EGFR外顯子21點突變，化療前陽性率為33.3%（11/33），化療后陽性率為42.4%（14/33），無統計學差異（P=0.08），其中化療前后均陽性7例，化療前后均陰性15例，化療前陰性化療后陽性7例，化療前陽性化療后陰性4例。

2.5 化療前后EGFR基因突變狀態變化與療效的關系 化療前后EGFR基因突變狀態變化與療效的關系見表3，可見基因突變狀態的變化與化療療效無明顯相關性（χ2=3.26,P=0.775）。

3 討論

本研究前瞻性分析了化療是否會對NSCLC患者EGFR基因突變狀態產生影響，結果顯示化療后EGFR基因敏感突變陽性率似乎高于化療前（54.5%vs39.4%），化療前后EGFR基因突變狀態一致率僅為54.5%（18/33）；不一致的15例中，10例由化療前EGFR基因突變陰性變為陽性，5例由化療前陽性變為陰性。

分析化療前后EGFR基因突變狀態發生變化的原因有很多推測或假設。首先，化療對于EGFR基因突變陽性的腫瘤細胞表現出更強的活性，可以使外周血中EGFR突變基因比例增高。IPASS研究[7]中EGFR基因突變陽性人群化療的客觀有效率為47.3%；日本NEJ002研究[8]中EGFR基因突變陽性人群一線化療的客觀有效率為29%；WJTOG3405研究[12]中EGFR基因突變陽性人群一線化療的客觀有效率為32.2%，均高于文獻報道的非選擇性人群含鉑雙藥方案的大約20%的客觀有效率，這提示EGFR基因突變陽性腫瘤對化療藥物更加敏感，化療可能使EGFR基因突變陽性的腫瘤細胞更易被殺傷，因而釋放更多DNA入血，因此化療后突變陽性比例升高。

其次，腫瘤在進展過程中EGFR基因突變狀態可能發生變化。Gow等[13]對67例NSCLC患者腫瘤組織及其相應的轉移灶進行EGFR基因突變檢測，結果顯示18例原發灶樣品EGFR基因突變陽性，而其中9例（50%）轉移灶表現為EGFR基因突變陰性，而轉移灶表現為EGFR基因突變陽性的26例樣品中，相應的原發灶有17例（65%）表現為突變陰性，原發灶與轉移灶EGFR基因突變狀態的不一致多是由于轉移灶表現為EGFR基因突變陽性而原發灶表現為陰性造成的。因此，在腫瘤發展過程中可能存在EGFR基因突變狀態的改變，而且可能以轉移灶EGFR基因突變陽性率增高為主。

化療也可能促使EGFR基因耐藥突變的產生。Chin等[14]將含有EGFR外顯子19缺失突變的NSCLC細胞系-PC9細胞系經過鉑類化療藥物處理耐藥后，再使用厄洛替尼，發現厄洛替尼的敏感性降低，說明化療可能在酪氨酸激酶激活通路中發揮作用。因此二/三線EGFR-TKIs治療有效率的降低可能部分歸因于化療導致的EGFR-TKIs耐藥，具體機制有待進一步臨床研究證實。

本研究結果提示化療前后肺腺癌患者的EGFR基因突變狀態可能會發生變化，本研究雖然采用了前瞻性設計來收集標本，但是仍然存在一定缺陷。樣本量小會產生一定的偏差，需要設計大樣本多中心的臨床試驗；采用外周血DNA檢測，雖然樣本能相對容易獲得，但不如組織標本更有說服力，需要化療前后的患者組織標本來證實我們發現的現象；本實驗中外周血標本是在化療前和化療后采集的，實際上應該采集化療前和化療后患者疾病進展時的標本進行檢測，更能對治療提供線索。因此希望能開展多中心大樣本的臨床試驗并收集化療前和化療后疾病進展時的組織標本進行檢測以證實化療對EGFR基因突變狀態的影響。

表2 33例患者化療前后EGFR基因突變狀態具體變化Tab 2 The EGFR gene mutation status of pre- and post-chemotherapy serum samples in 33 patients enrolled

表3 33例患者化療前后EGFR基因突變狀態變化與療效的關系Tab 3 The profile of EGFR gene mutation status of pre- and post-chemotherapy serum samples and its relation with efficacy of chemotherapy in 33 patients enrolled