抑制Src酪氨酸激酶對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9的影響

鄭銳 秦曉松 李文潔 康健

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一組金屬離子依賴的蛋白酶,主要分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素和膜型MMPs(MT-MMPs) 4種類型[1].細(xì)胞間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等均可分泌MMPs.它們能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分,包括膠原、層聯(lián)蛋白、纖維聯(lián)結(jié)蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等[2].MMPs與腫瘤細(xì)胞浸潤突破基底膜、穿透血管、原位和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移瘤的生長和血管形成密切相關(guān)[3].包括肺癌在內(nèi)的人類很多腫瘤均存在MMPs特別是明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)、MT1-MMP以及基質(zhì)溶解素-3(MMP-11)的過度表達(dá)[4,5].

原癌基因C-Src是生長因子受體信號通路中的重要成分,在調(diào)控細(xì)胞的生長、粘附、運動和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用,其異常表達(dá)和活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6].研究[7,8]表明,抑制Src酪氨酸激酶活性能夠降低胰腺癌和前列腺癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性,抑制癌細(xì)胞的侵襲和浸潤.本研究應(yīng)用選擇性Src酪氨酸激酶抑制劑作用于NSCLC細(xì)胞株,旨在研究抑制Src酪氨酸激酶對非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9的影響以及對NSCLC細(xì)胞體外侵襲浸潤的影響.

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品和設(shè)備 人肺腺癌PC14PE6細(xì)胞和鱗癌H226細(xì)胞為美國德州大學(xué)安德森癌癥中心所贈;人肺腺癌A549細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物保藏所;人肺腺癌PC-9細(xì)胞購于日本IBL公司.選擇性Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉衍生物由英國AstraZeneca公司提供.Biotrak MMP-2和MMP-9活性分析試劑盒購自英國Amersham Pharmacia Biotech公司.膠原I購自BD Biosciences公司.纖維聯(lián)結(jié)蛋白購于日本巖城硝子公司.Transwell chambers購自Costar Cambridge.Diffi-Quik染色系統(tǒng)購自美國Baxter Scientif i c Products McGraw Park IL.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC14PE6細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,A549細(xì)胞、PC-9細(xì)胞和H226細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37oC、5%CO2飽和濕度培養(yǎng).每毫升培養(yǎng)液含100 U青霉素、100 μg鏈霉素.

1.3 ELISA法檢測MMP-2和MMP-9含量[9]NSCLC細(xì)胞4X 105/mL接種于6孔板,于無血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育24 h,用不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑(0.1 μM、1 μM、3 μM和10 μM)37oC下孵育6 h,收集培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測NSCLC細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2和MMP-9的含量.MMP-2和MMP-9的檢出限分別為0.75 ng/mL和0.25 ng/mL.

1.4 改良的Boyden chamber方法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對肺癌細(xì)胞侵襲浸潤的抑制作用[10]使用膠原I(30 μg/filter)包埋孔徑為8 μm的transwell小室.血清饑餓24 h的肺癌細(xì)胞(1X105/200 μL)懸浮于含有不同濃度Src酪氨酸激酶抑制劑(0.1 μM、0.3 μM、1 μM和3 μM)的培養(yǎng)液中,加到槽的上層.含有10 μg/mL纖維聯(lián)結(jié)蛋白的趨化液加到槽的下層.置37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后,用棉棒擦掉未浸潤到下層的細(xì)胞,切下分隔膜,使用Diff-Quik系統(tǒng)進(jìn)行固定和染色.在200倍亮視野顯微鏡下隨機選取6個視野計數(shù)細(xì)胞數(shù),取3個獨立實驗的平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.在進(jìn)行侵襲浸潤實驗的同時,用MTT法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對細(xì)胞生存活力的影響.

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 NSCLC細(xì)胞株中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平 ELISA結(jié)果顯示,在4株NSCLC細(xì)胞系中,MMP-2和MMP-9均可在PC14PE6和H226細(xì)胞中表達(dá),兩者培養(yǎng)上清中MMP-2水平分別為9.21 ng/mL和2.28 ng/mL,MMP-9水平分別為0.87 ng/mL和0.75 ng/mL.A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-9水平為0.57 ng/mL,A549細(xì)胞中MMP-2水平以及PC-9細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9水平均檢測不到(圖1).2.2 Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6和H226細(xì)胞中MMP-2水平的影響 如圖2所示,Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6細(xì)胞中MMP-2的水平呈劑量依賴性抑制關(guān)系,當(dāng)濃度達(dá)到10 μM時,其對PC14PE6中MMP-2的抑制程度超過50%.相同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑對H226細(xì)胞中的MMP-2水平無明顯抑制作用.

2.3 Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6、H226和A549細(xì)胞中MMP-9水平的影響 如圖3所示,Src酪氨酸激酶抑制劑與PC14PE6、H226和A549細(xì)胞中的MMP-9呈劑量依賴性抑制關(guān)系.10 μM Src酪氨酸激酶抑制劑使H226細(xì)胞和

圖 1 NSCLC細(xì)胞株中MMP-2、MMP-9的分泌情況.A:MMP-2;B:MMP-9.Fig 1 Secretion of MMP-2, MMP-9 by NSCLC cell lines. A: MMP-2; B:MMP-9.

圖 2 Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6和H226細(xì)胞分泌MMP-2的影響Fig 2 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on secretion of MMP-2 by PC14PE6 and H226 cells

圖 3 Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6、H226和A549細(xì)胞分泌MMP-9的影響Fig 3 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on secretion of MMP-9 by PC14PE6, H226 and A549 cells

圖 4 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細(xì)胞體外侵襲浸潤的影響Fig 4 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on NSCLC cell invasiveness

2.4 Src酪氨酸激酶抑制劑對4種NSCLC細(xì)胞體外侵襲浸潤的影響 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細(xì)胞體外侵襲浸潤具有明顯的抑制作用,對不同細(xì)胞的抑制程度略有差別.1 μM和3 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對分泌高水平MMP-2和MMP-9的PC14PE6和H226細(xì)胞體外侵襲浸潤具有明顯的抑制作用,抑制率分別為54.73%(P<0.001)和79.1%(P<0.001)以及36.88%(P<0.001)和68.09%(P<0.001).0.3 μM、1 μM和3 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對僅分泌MMP-9的A549細(xì)胞體外侵襲浸潤作用更敏感,制率分別為36.35%(P<0.001)、77.9%(P<0.001)和90.96%(P<0.001).而0.1 μM、0.3 μM、1 μM和3 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對檢測不出MMP-2和MMP-9的PC-9細(xì)胞體外侵襲浸潤的作用最敏感,抑制率分別為63.46%(P<0.001)、82.69%(P<0.001)、91.67%(P<0.001)和96.98%(P<0.001).

3 討論

上皮腫瘤轉(zhuǎn)移涉及一系列的復(fù)雜過程,而細(xì)胞浸潤突破基底膜被認(rèn)為是最關(guān)鍵的步驟[6].由于MMPs能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分,所以它在此過程中發(fā)揮重要作用.MMPs的過度表達(dá)和活化與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1,3,5,11].腫瘤細(xì)胞可以通過可溶性遞質(zhì)或膜結(jié)合分子與間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行信息交換,協(xié)同產(chǎn)生和調(diào)節(jié)MMPs,這在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制中具有重要意義[5].MMPs過度表達(dá)在包括肺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中均與預(yù)后不良有關(guān)[12-14].目前已鑒定出30多種結(jié)構(gòu)有關(guān)聯(lián)的MMPs,其中分子量為72 kDa和92 kDa的MMP-2和MMP-9能降解多種膠原、明膠、彈性蛋白和層聯(lián)蛋白等,在人類很多腫瘤中都有很高的表達(dá)和活化,是肺癌中主要的蛋白水解酶[4,5].肺癌組織中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平的上調(diào)使肺癌細(xì)胞具有降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的能力,肺癌細(xì)胞突破各種屏障的能力增強,侵襲轉(zhuǎn)移能力增強[15].

本研究發(fā)現(xiàn),NSCLC細(xì)胞中PC14PE6和H226細(xì)胞株表達(dá)高水平的MMP-2和MMP-9,A549細(xì)胞株表達(dá)低水平的MMP-9,而MMP-2和MMP-9在PC-9細(xì)胞株中低于檢測限.結(jié)合前期的研究[9],PC14PE6和H226細(xì)胞中明膠酶活性可能歸于MMP-2和MMP-9,A549細(xì)胞明膠酶活性可能主要歸于其它的蛋白水解酶,如胰蛋白酶,部分活性歸于MMP-9.在腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移過程中MMPs的表達(dá)是多水平嚴(yán)格調(diào)控的,包括基因的活化、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白酶的分泌、酶原的激活、特異性抑制因子以及活性酶的降解和清除.其中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平和酶原的激活.細(xì)胞內(nèi)MAPK系統(tǒng)亦參與MMPs的表達(dá)調(diào)控,其途徑為多種生長因子、細(xì)胞因子通過其膜受體激活Ras/Raf/MEK/MAPK(ERK1/2或p38)通路,通過轉(zhuǎn)錄因子AP-1和EST調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)[16].

Src蛋白能和許多生長因子受體相互作用,在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MMPs活性以及細(xì)胞侵襲浸潤的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用.研究[7,8]表明,Src酪氨酸激酶抑制劑(>2 μM)能夠抑制前列腺癌PC3細(xì)胞中MMP-9的活性以及胰腺癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性.本研究發(fā)現(xiàn),高濃度(≥3 μM)Src酪氨酸激酶抑制劑可明顯抑制NSCLC細(xì)胞PC14PE6、H226和A549細(xì)胞分泌MMP-9以及PC14PE6細(xì)胞分泌MMP-2.而在細(xì)胞侵襲浸潤實驗中,亞微摩爾水平Src酪氨酸激酶抑制劑明顯抑制PC-9細(xì)胞的體外侵襲浸潤,1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑能明顯抑制A549、PC14PE6和H226細(xì)胞的體外游走浸潤.由此可見,抑制NSCLC細(xì)胞游走浸潤所需要的Src酪氨酸激酶抑制劑的濃度明顯低于抑制MMPs活性所需要的藥物濃度.由于PC-9細(xì)胞中MMP-2和MMP-9活性檢測不出,推測Src酪氨酸激酶不是通過調(diào)節(jié)MMPs活性來促進(jìn)PC-9細(xì)胞的游走浸潤.而在NSCLC細(xì)胞A549、PC14PE6和H226中,Src酪氨酸激酶對細(xì)胞侵襲浸潤的調(diào)節(jié)不僅是通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的活性來發(fā)揮作用的.Src酪氨酸激酶還可以通過p190RhoGAP和粘著斑激酶的磷酸化調(diào)控細(xì)胞骨架的重組,調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和運動[6,17],促進(jìn)上皮基質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而削弱正常上皮間的粘附,刺激腫瘤細(xì)胞的侵襲和浸潤.

綜上所述,NSCLC細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9呈現(xiàn)細(xì)胞異質(zhì)性,抑制Src酪氨酸激酶能夠抑制NSCLC細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9以及NSCLC細(xì)胞的體外侵襲浸潤.MMP-2和MMP-9參與Src酪氨酸激酶介導(dǎo)的某些NSCLC細(xì)胞體外侵襲浸潤,但不是唯一決定因素.