宣威地區肺癌患者血清和肺組織硒水平研究

周嵐 黃云超 王竹 葉聯華 候文俊 楊凱云

肺癌是一種嚴重威脅人類健康和生命的疾病,在全球,肺癌的發病率和死亡率均居惡性腫瘤之首[1].宣威地區位于滇東北,是云南省主要產煤基地,肺癌死亡率為91.11/10萬,是我國肺癌高發地區[2].女性發病率高、年輕化、家族聚集性明顯是宣威地區肺癌發病的主要特點[3].

硒是人類必需的微量營養素.有研究[4-6]發現腫瘤的死亡率與硒的地理分布及攝入量呈負相關,肺癌死亡率與當地人群血硒水平呈負相關[7,8].據報道宣威肺癌高發區土壤硒的含量低于中國背景值[9],我們推測該地區肺癌高發可能與低硒有關,為此本研究檢測了宣威肺癌患者的血清硒含量和肺組織硒水平,以初步探討宣威地區肺癌高發與硒的關系.

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 血清 2007年1月-2008年12月間云南省腫瘤醫院胸心外科和胸外科就診的原發性肺癌患者60例,女性,年齡38歲-70歲,平均52歲,經組織和/或細胞病理檢查確診.2007年1月-2008年12月間云南省宣威市人民醫院外二科收治的非腫瘤非呼吸道疾病外傷患者60例,女性,年齡35歲-65歲,平均51歲.試驗組與對照組均為女性,年齡無統計學差異(P=0.444).兩組均在宣威或富源居住2年以上,排除合并糖尿病和肝臟疾病,排除有吸煙史和飲酒史.吸煙史指連續吸煙超過6個月,飲酒史指每周喝酒1次并連續6個月以上.簽署知情同意書后,抽取靜脈血3 mL置于血清管中,離心取血清1 mL,-80oC冰箱保存.

1.1.2 肺組織 2007年1月-2008年12月間云南省腫瘤醫院胸心外科和胸外科收治的原發性肺癌患者60例,術中取新鮮肺癌組織、癌旁肺組織(距癌組織邊緣2 cm的肺組織)、正常肺組織(距癌組織邊緣>5 cm的肺組織).其中宣威地區患者(指在宣威或富源居住2年以上)31例,年齡38歲-62歲,平均48歲;男性10例,女性21例;腺癌21例,鱗癌10例;I期15例,II期11例,III期5例.非宣威地區患者29例,年齡40歲-61歲,平均52歲;男性18例,女性11例;腺癌10例,鱗癌19例;I期6例,II期18例,III期5例.宣威地區和非宣威地區患者年齡無統計學差異,兩組均經手術后病理學證實,排除合并其它腫瘤、糖尿病和肝臟疾病.-80oC冰箱保存.

1.2 主要試劑與儀器 硒標準液、質控豬肉粉、質控小牛血清、DAN試劑、鉬酸鈉、EDTA、濃鹽酸(36%-38%)、氨溶液、環己烷均購自北京化學試劑公司.熒光光譜儀F-7000購自日本Hitachi公司.

1.3 配制試劑 0.1%DAN試劑:在暗室內稱取DAN 200 mg,加入0.1 mol/L鹽酸200 mL,振搖15 min.加入40 mL環己烷,振搖5 min,將此液倒入塞有脫脂棉的分液漏斗中,待分層后濾去環己烷層.純化后的DAN溶液儲于棕色瓶中,加入1 cm厚環己烷覆蓋表層.置冰箱內保存.混合酸液:稱取鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)7.5 g溶于150 mL水中.加入過氯酸(70%-72%)和150 mL去硒硫酸,混勻.EDTA混合液:將A液100 mL、B液10 mL、C液5 mL混合,加水稀釋至1,000 mL.A液(0.2 g/mol EDTA二鈉鹽):稱取37 g EDTA加熱至完全溶解,冷卻后稀釋至500 mL.B液(10%鹽酸羥胺溶液):稱取10 g鹽酸羥胺溶于水,稀釋至100 mL.C液(0.02%甲酚紅指示劑):稱取甲酚紅50 mg溶于少量水中,加12.5%氨水1滴,完全溶解后加水稀釋至250 mL.

1.4 樣品消化 常溫下解凍血清和組織.稱取肺癌組織、癌旁肺組織和正常肺組織各0.5 g.將血清及組織分別放入磨口三角瓶內.加10 mL混合酸液,放置過夜.于沙浴上加熱,當激烈反應發生后溶液變為清亮無色并伴有白煙出現,繼續加熱至溶液呈現黃色,立即取下,冷卻后溶液仍轉為無色.

1.5 生成并測定4,5-苯并苤硒腦 消化完畢的溶液中加入20 mL EDTA混合液,混勻后溶液呈深粉紅色,用氨溶液及濃鹽酸調至略成粉紅橙色,pH1.5-2.0,于冷水中冷卻.以下在暗室內操作:加入DAN試劑3 mL,混勻后置沸水浴中加熱5 min.冷卻后,加環己烷3.0 mL,振搖4 min.將全部溶液移入分液漏斗,待分層后放掉水層,將環己烷層由分液漏斗上口傾入帶蓋試管中,于原子熒光光譜儀上用激發光波長376 nm、放射光波長520 nm測定苤硒腦的熒光強度.

1.6 繪制硒標準曲線 精確取標準硒溶液(0.05 μg/mL)0 mL、0.2 mL、1.0 mL、2.0 mL及4.0 mL加去離子水至5 mL后,按樣品步驟同時進行測定,繪制標準曲線.

1.7 質量控制 正式分析樣品前,分別取質控小牛血清和豬肉粉,檢測標樣中的硒含量,以檢驗熒光光譜儀的精密度和準確度.

1.8 計算 每克樣品中硒含量(μg)=[標準硒含量(μg)/(標準硒熒光讀數-空白熒光讀數)]X[(樣品熒光讀數-空白熒光讀數)/樣品重量(g)].

1.9 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析.數據采用Mean±SD表示.組間差異比較采用單因素方差分析.以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 血清硒水平 試驗組血清硒濃度為(55.22±13.34)μg/L,對照組為(60.33±13.82)μg/L,兩組相比差異有統計學意義(P=0.041).

2.2 肺組織硒水平 60例肺癌患者的硒含量為肺癌組織低于癌旁肺組織(P<0.05),癌旁肺組織低于正常肺組織(P<0.05),肺癌組織明顯低于正常肺組織(P<0.01)(表1).兩個地區肺癌組織、癌旁肺組織和正常肺組織間比較,硒水平無統計學差異,宣威地區肺癌組織硒含量低于該地區正常肺組織水平(P<0.05)(表2).腺癌和鱗癌、不同分期的肺癌組織、癌旁肺組織和正常肺組織之間的硒水平均無統計學差異.

表 1 肺癌患者肺組織硒水平Tab 1 Mean levels of lung tissue Se measurements in lung cancer patients

表 2 宣威地區和非宣威地區肺癌患者肺組織硒水平Tab 2 Mean levels of lung tissue Se measurements in lung cancer patients according to different residence from Xuanwei and non-Xuanwei

3 討論

血清硒含量是反映人體近期硒營養狀況的良好指標,受飲食習慣、年齡、性別等多因素的影響.血清硒在85 μg/L以上被認為硒營養狀況充足[10].

本研究以宣威女性作為研究對象,排除了性別、吸煙和飲酒等影響因素后,觀察到宣威女性肺癌患者及非腫瘤非呼吸道疾病患者平均血清硒含量均低于85 μg/L,宣威女性普遍存在硒營養不足,究其原因,可能與宣威地區地處低硒環境及當地居民的膳食結構有關.宣威肺癌高發區土壤總硒含量為(0.202,5±0.099,5)mg/kg,低于中國正常地區土壤硒水平(0.302,4 mg/kg)[9],環境硒通過食物鏈影響人體硒營養狀況.宣威地區90%以上的人口是農民,膳食內容以植物性食物為主,絕大多數為自種自產的大米、玉米和馬鈴薯,較少攝入含硒豐富的食物如海產品等.本研究發現肺癌患者平均血清硒含量比對照組低8.47%,提示機體低血硒狀態會增加肺癌的發生,低硒是導致宣威肺癌高發的原因或是其結果需進一步探討.

組織硒含量是反映機體長期硒負荷水平的指標,與血清硒濃度有關.正常成人肺組織硒含量為0.146 μg/g(濕重)[11].本研究對宣威地區和非宣威地區肺癌患者的肺癌組織、癌旁肺組織、正常肺組織硒含量進行了分析,結果發現,宣威地區和非宣威地區肺癌組織硒含量均低于癌旁肺組織和正常肺組織,呈現從低到高的變化趨勢,癌組織有過度消耗硒的現象.前期研究[12]發現適宜濃度的硒在體外對云南宣威女性肺腺癌細胞系(XWLC-05)具有抑制細胞生長及誘導凋亡的作用,細胞內一定濃度的硒對維持細胞正常功能具有一定保護作用.本研究提示組織細胞低硒可能是導致癌變的潛在危險因素.細胞內適宜濃度的硒通過提高谷胱甘肽過氧化物酶的活性、清除自由基和過氧化物、保護細胞膜功能、穩定DNA結構的穩定性、調節細胞周期促進癌細胞凋亡等機制起到抑癌作用[13-15].

宣威地區肺癌的發生與低血硒狀態有關,肺組織細胞低硒可能是導致癌變的潛在危險因素.硒作為營養促癌因素,其作用機制還有待于通過營養調查和營養分析等做進一步研究.

致謝:衷心地感謝中國預防醫學科學院食品與安全所周瑞華老師對本研究給予的無私支持!