丹參酮類化合物對SPC-A-1細胞的生長抑制及其構效關系探討

石華月 張青 李慧 儲婷 金輝 毛聲俊

肺癌在我國已占據惡性腫瘤發病率及死亡率的第1位,調查數據顯示,我國肺癌的發病率和死亡率一直呈上升趨勢.盡管近20年來肺癌的治療有了很大的進展,但肺癌患者的預后卻無明顯提高,5年生存率僅10%-15%,而其它腫瘤的平均5年生存率能達到62%-97%[1,2].肺癌的流行及其嚴重危害已使其治療藥物成為臨床不可缺少且地位極其重要的一大類藥物.因此,尋找新的抗癌藥物對肺癌的治療具有重大意義.

丹參為唇形科鼠尾草屬植物(Salvia miltiorrhiza bunge)的干燥根部,具有祛瘀止痛、活血調經、養心除煩等功效,入藥歷史悠久.丹參酮(Tanshinone, Tan)作為丹參根部的乙醚或乙醇提取物,是丹參的主要有效部位.按其不同的化學結構可分為丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮I等15種成分(圖1).近年來大量研究[3-6]證實,丹參酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性,是一種有前途的抗癌藥物.本研究以人肺腺癌細胞株SPC-A-1為研究對象,考察丹參酮類化合物(丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I)對其生長抑制作用,并比較四者對SPC-A-1細胞株的藥效學差異,為探討丹參酮類化合物細胞毒性與其結構之間的關系以及開發用于治療肺癌的丹參酮制劑提供實驗依據.

圖 1 丹參酮類化合物化學結構.A:丹參酮類化合物基本結構;B:二氫丹參酮I;C:丹參酮I;D:丹參酮IIA;E:隱丹參酮.Fig 1 Chemical structures of Tanshinones. A: basic structure of Tanshinones; B: Dihydrotanshinone I; C: Tanshinone I; D: TanshinoneIIA; E:Cryptotanshinone.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品 RPMI-1640培養基為美國Gibco公司產品;標準新生牛血清為鄭州伯安生物工程有限公司產品;四甲基偶氮唑藍(MTT)為BIOSHARP公司產品;二甲基亞砜(DMSO)分析純為天津市博迪化工有限公司產品;十二烷基硫酸鈉(SDS)分析純為廣東光華化學廠有限公司產品;亞砷酸注射液(H3AsO3)為哈爾濱伊達藥業有限公司產品,實驗前用RPMI-1640培養液稀釋成2 μg/mL的藥液;丹參酮IIA為西安天豐生物科技有限公司產品,由本實驗室精制,純度達99.2%(HPLC);丹參酮I、二氫丹參酮I、隱丹參酮均為成都曼思特生物科技有限公司產品;丹參酮類化合物均用DMSO溶解(DMSO終濃度為0.03%,一般認為DMSO≤0.1%時,不引起細胞生物學形態改變),配制成1.7 mg/mL的儲備液,過濾除菌,于4oC條件下避光保存備用.

1.1.2 細胞株 人肺腺癌SPC-A-1細胞株由生物治療國家重點實驗室提供,用含10%滅活標準新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液,于37oC、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養,每2-3天傳代1次.實驗用對數生長期細胞.

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期的SPC-A-1細胞,消化制成單細胞懸液后計數,調整其密度為2X104個/mL,接種于96孔板中,每孔100 μL;接種細胞后,于37oC、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養4 h后給藥.以等體積的亞砷酸(2 μg/mL)作為參比藥物組,不加藥的細胞組作為空白對照組,RPMI-1640培養液組作為空白組用以調零.給藥組分別加入不同濃度的丹參酮IIA、丹參酮I、二氫丹參酮I和隱丹參酮,給藥濃度分別為2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0 μg/mL,每個濃度設6個復孔,每孔20 μL.分別于培養24 h、48 h、72 h后,加入5 mg/mL MTT液(每孔20 μL),于37oC、5%CO2孵箱中繼續培養.4 h后按照文獻[7]中的方法,加入由異丁醇、濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)配制的甲瓚裂解液(100 μL/孔),于37oC、5%CO2培養箱中孵育過夜至甲瓚全部溶解,微孔板恒溫震蕩儀震蕩10 min,使完全混勻.酶標儀570 nm(參比波長630 nm)處測各孔光密度(optical density, OD)值,以該復孔的平均值作為該組細胞的OD值,實驗重復3遍,結果取其平均值,并按公式計算細胞生長抑制率.細胞增殖抑制率計算公式為:

抑制率=(1-實驗組平均OD值/空白對照組平均OD值)X100%.

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態生長情況 在加藥實驗過程中,分別于24 h、48 h和72 h觀察丹參酮化合物組(4.0 μg/mL)、參比藥物組(2 μg/mL)以及空白對照組細胞的生長情況.

1.2.3 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析,數據以Mean±SD表示,組間比較采用One way ANOVA檢驗,P<0.05為有統計學差異.

2 結果

2.1 丹參酮類化合物對SPC-A-1細胞的增殖抑制作用SPC-A-1細胞經4種藥物處理后,與空白對照組相比,其OD值均有不同程度的下降,且隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長,OD值下降趨勢明顯(表1-表4).其中,二氫丹參酮I組、丹參酮I組中細胞的OD值下降較明顯,2.0 μg/mL處理24 h后,其OD值與對照組相比有統計學差異;二氫丹參酮I組、丹參酮I組和丹參酮IIA在2.0 μg/mL處理24 h后表現出增殖抑制作用.隱丹參酮組起效較慢,6.0 μg/mL作用24 h才表現出增殖抑制作用,且2.0 μg/mL隱丹參酮分別作用48 h和72 h時抑制作用均不明顯,OD值與對照組相比均無統計學差異.與參比藥物組相比,4種藥物對細胞的增殖抑制作用均與亞砷酸作用趨勢一致,且4.0 μg/mL二氫丹參酮I、4.0 μg/mL丹參酮I、8.0 μg/mL丹參酮IIA、10.0 μg/mL隱丹參酮作用72 h后的抑制率(分別為83.40%、72.57%、62.37%、69.96%)與2 μg/mL亞砷酸作用72 h(65.22%)的抑制率相當或更高.4種藥物(二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮)作用24 h后IC50值分別為2.77 μg/mL、6.01 μg/mL、>10.00 μg/mL和>10.00 μg/mL;作用48 h的IC50值分別為1.80 μg/mL、4.04 μg/mL、8.12 μg/mL、8.71 μg/mL;作用72 h的IC50值分別為1.36 μg/mL、1.69 μg/mL、3.81 μg/mL、7.35 μg/mL,可見4種藥物中二氫丹參酮I起效濃度最低,其次為丹參酮I、丹參酮IIA和隱丹參酮,且其抑制率均呈明顯的時間正相關性(表5).

2.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態 SPC-A-1細胞培養48 h后,空白對照組可見貼壁生長、細胞清晰,胞質飽滿,核膜、核仁輪廓明顯,相鄰細胞生長融合成片(圖2A);2 μg/mL亞砷酸組(圖2B)可見視野中大部分細胞失去貼壁特性,細胞逐漸由貼壁而脫落,細胞皺縮、體積變小、變形,呈現出明顯的增殖抑制作用與細胞凋亡特征;二氫丹參酮I組(圖2C)和丹參酮I組(圖2D)中的細胞形態與亞砷酸組相似,多數細胞由貼壁而脫落,出現細胞變小、皺縮和變形現象,且與空白對照組相比視野中細胞數明顯減少;丹參酮IIA組(圖2E)和隱丹參酮組(圖2F)中,可見部分細胞由貼壁而脫落,呈現細胞皺縮、變小和變形的狀態,與空白對照組相比視野中細胞數明顯減少,但較二氫丹參酮I組(圖2C)和丹參酮I組(圖2D)視野中細胞數較多.該結果表明,四種丹參酮類化合物均能抑制SPC-A-1細胞生長,誘導其凋亡,其中二氫丹參酮I作用強度最強,丹參酮I和丹參酮IIA次之,隱丹參酮的作用強度則相對較弱,與MTT檢測的結果一致.

表 1 不同濃度二氫丹參酮I在不同時間點對SPC-A-1細胞的生長抑制作用(Mean±SD)Tab 1 Growth inhibition effect of Dihydrotanshinone I over a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times(Mean±SD)

3 討論

丹參酮是中藥丹參的主要脂溶性成分,目前已有大量報道其在體外能對抗多種腫瘤細胞,作用機制主要涉及抑制腫瘤細胞增殖[8]、誘導細胞凋亡與分化、抑制細胞侵襲及轉移[9]等方面.2008年,Lee[10]觀察研究了二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA及隱丹參酮對HepG2細胞的毒性作用與GSH/GSSG(還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)比例變化之間的關系,結果表明二氫丹參酮I及丹參酮I誘導的細胞毒性作用與GSH/GSSG比例變化呈明顯的正相關性,而丹參酮IIA及隱丹參酮則無此相關性;Wayne[11]用此4種丹參酮化合物處理p53基因表型不同的3株肝癌細胞系以及Pgp過表達的R-HepG2細胞,結果發現二氫丹參酮I及丹參酮I對4種肝癌細胞均有較好的增殖抑制作用,而隱丹參酮和丹參酮IIA則對Pgp過表達的R-HepG2更有效,其中隱丹參酮能有效抑制Pgp介導的藥物外排,丹參酮IIA與阿霉素聯用則表現出最強的藥物協同作用.這些研究結果表明不同的丹參酮化合物的抗腫瘤活性存在分子機制上的差異,提示這可能與其化學結構不同有關.

表 2 不同濃度丹參酮I在不同時間點對SPC-A-1細胞的生長抑制作用(Mean±SD)Tab 2 Growth inhibition effect of TanshinoneⅠover a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times (Mean±SD)

表 3 不同濃度丹參酮IIA在不同時間點對SPC-A-1細胞的生長抑制作用(Mean±SD)Tab 3 Growth inhibition effect of Tanshinone IIA over a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times (Mean±SD)

表 4 不同濃度隱丹參酮在不同時間點對SPC-A-1細胞的生長抑制作用(Mean±SD)Tab 4 Growth inhibition effect of Cryptotanshinone over a range of concentrations on SPC-A-1 cell line at different times (Mean±SD)

表 5 丹參酮類化合物對SPC-A-1的IC50值(24 h、48 h和72 h)Tab 5 IC50 of Tanshinones on SPC-A-1 cells at 24 h, 48 h and 72 h

圖 2 SPC-A-1細胞培養48 h的倒置顯微鏡圖.A:未經藥物處理的細胞;B:2.0 μg/mL亞砷酸組;C:4.0 μg/mL二氫丹參酮I組;D:4.0 μg/mL丹參酮I組;E:4.0 μg/mL丹參酮ⅡA組;F:4.0 μg/mL隱丹參酮組.Fig 2 Cell morphology observed by inverted phase contrast microscope after incubated for 48 h. A: no treatment; B: treated with 2 μg/mL arsenious acid; C: treated with 4.0 μg/mL dihydrotanshinone I; D:treated with 4.0μg/mL tanshinone I; E: treated with 4.0 μg/mL tanshinone IIA; F: treated with 4.0 μg/mL cryptotanshinone.

本研究以人肺腺癌細胞株SPC-A-1作為細胞模型,研究比較了丹參酮類4種化合物(丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I)的細胞毒性作用,結果表明4種化合物均能有效抑制細胞生長,且抑制作用呈明顯的時間、濃度依賴性.通過比較4種化合物作用24 h、48 h、72 h后的IC50值可發現,4種化合物的細胞增殖抑制作用強度依次為二氫丹參酮I、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮,此結果與葉因濤等[12]在宮頸癌HeLa細胞研究方面實驗結論基本一致,而在肺癌研究領域還無相關報道,本研究對于開發用于治療肺癌的丹參酮制劑有重要意義.丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮及二氫丹參酮I均為丹參二萜醌類化合物,其結構差異主要表現在A環與C環的不同(圖1).本實驗結果表明,A環為芳環的化合物(二氫丹參酮I和丹參酮I)的細胞毒性明顯強于A環為脂環的化合物(丹參酮IIA和隱丹參酮),其原因可能是當A環為芳環時,可影響整個分子的三維圖像,表現為使B、C兩個環平面之間的兩面夾角減小,從而增強化合物細胞毒性[13].對于呋喃環和醌類產生細胞毒性的作用機制,長期以來的觀點是其能產生自由基而引起DNA損傷.2008年,Zhang[14,15]否認了這一假設,其研究結果顯示丹參酮IIA的呋喃氧并不產生自由基,而是通過與DNA雙螺旋中腺嘌呤上的N形成氫鍵,改變DNA構型,導致RNAPII磷酸化并降解,激活p53基因,從而產生誘導細胞凋亡的作用;并進一步認為,當C環為二氫呋喃環時,由于氧原子上的孤對電子不參與共軛,其電負性更強,更易形成氫鍵,因此細胞毒性應強于C環為呋喃環的化合物.這一結論雖可用于解釋二氫丹參酮I的細胞毒性強于丹參酮I,但卻與丹參酮IIA細胞毒性強于隱丹參酮這一實驗結果相悖,說明這其中還存在有其它的因素,如呋喃氧發揮細胞毒性作用是否僅為與DNA小溝結合,A環為脂環時對呋喃氧及二氫呋喃氧的成鍵是否存在影響等.因此,對于丹參酮類化合物的細胞毒性與其結構之間的關系有待更深入的研究與探討,方能更全面地闡釋其細胞毒性的分子機理,為對其進行結構改造和修飾,進而研制開發有效的創新抗癌藥物提供理論與實驗基礎.