BRD7在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳龍 喻風(fēng)雷

溴區(qū)包含蛋白7（bromodomain-containing protein 7,BRD7）基因?qū)儆赽romodomain家族成員，該家族的大多數(shù)成員與上皮類腫瘤、惡性血液病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。過表達(dá)BRD7基因可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，并部分逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞的惡性表型[2]。基于BRD7在鼻咽癌中的作用及與上皮類腫瘤的密切關(guān)系，推測BRD7可能參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在通過免疫組化技術(shù)檢測BRD7在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織中的表達(dá)，探討B(tài)RD7基因在NSCLC臨床和病理診斷中可能的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月-2011年5月中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院有明確病理診斷的NSCLC手術(shù)標(biāo)本101例作為實(shí)驗(yàn)組，并取其中33例正常組織（距癌組織＞10 cm）標(biāo)本作為對照組，以上標(biāo)本切取后立即置于液氮中保存?zhèn)溆茫溆嗖糠殖Ｒ?guī)送病理檢查。

101例NSCLC包括男性81例，女性20例，年齡36歲-78歲，平均53歲。根據(jù)2004年WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類：鱗癌44例，腺癌52例，大細(xì)胞癌5例；高分化7例，中分化73例，低分化16例（大細(xì)胞癌屬于未分化癌，故未納入該分組）。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：I期52例，II期17例，III期32例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者47例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者54例。所有患者術(shù)前均未行化療、放療等輔助治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與方法 大鼠抗-BRD7單抗原液（1.0 mg/mL）購自美國Sigma生物技術(shù)公司，即用型二步法大鼠免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)方法：標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，4 μm厚連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)HE染色進(jìn)行組織學(xué)認(rèn)定后，采用免疫組化二步法檢測BRD7在不同肺組織中的表達(dá)。DAB顯色，以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性肺癌切片作陽性對照。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞內(nèi)呈棕色顆粒者為陽性染色。根據(jù)染色細(xì)胞百分率和染色程度進(jìn)行評定和分析。每例均隨機(jī)觀察10個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞率計分標(biāo)準(zhǔn)：≤10%為0分，11%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度：淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。最后按乘積分?jǐn)?shù)分為4個等級：0分為陰性（-），1分-4分為弱陽性（+），5分-8分為中度陽性（++），9分-12分為強(qiáng)陽性（+++）。結(jié)果判斷：將（-）和（+）定為陰性表達(dá)，（++）和（+++）定為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRD7在NSCLC癌組織、正常肺組織中的表達(dá) BRD7蛋白的表達(dá)以細(xì)胞核為主，在正常肺組織中很少見到淺棕色顆粒，表明BRD7蛋白在正常肺組織中低表達(dá)或不表達(dá)；在癌組織中可以看到大部分組織都出現(xiàn)較多的棕色或深棕色顆粒，顯示BRD7蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖1）。BRD7蛋白在正常肺組織組及NSCLC組表達(dá)陽性率分別為6.1%（2/33）和76.2%（77/101），兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=50.622, P＜0.001）。

2.2 BRD7的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者BRD7的陽性表達(dá)率（89.4%）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（64.8%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。BRD7的陽性表達(dá)率隨著TNM分期的升高而升高，I期、II 期、III期患者中分別為65.4%、76.5%、93.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012）。BRD7的表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、病理類型、分化程度無關(guān)（P＞0.05）（表1）。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中約有80%為NSCLC。近年來NSCLC發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升和年輕化趨勢，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的多基因調(diào)控異常的過程[3,4]。因此，研究肺癌的病因、發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。BRD7基因是1999年克隆的一個新的bromodomain基因，該基因定位于染色體16q12.1-12.2， cDNA全長2,317 bp，其編碼產(chǎn)物BRD7蛋白是一種含溴區(qū)（bromodomain）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，屬于bromodomain家族成員[5]。溴區(qū)結(jié)構(gòu)域是一個進(jìn)化上高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，可特異性地與組蛋白末端乙酰化的賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合，并將核內(nèi)的組蛋白乙酰化信號傳遞給轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[6]。近年來國內(nèi)研究人員對BRD7基因在鼻咽癌中的功能研究結(jié)果[7,8]表明，BRD7在鼻咽癌中具有抑瘤作用。

研究[9-11]表明BRD7基因是一個p53依賴的抑癌基因，BRD7基因與p300相互作用，通過溴區(qū)結(jié)構(gòu)域連接乙酰化組蛋白，幫助維持p53轉(zhuǎn)錄時連接位點(diǎn)的組蛋白在一個合適的乙酰化狀態(tài)；同時BRD7基因被鑒別為BRG1的特有的染色體重塑復(fù)合體，可減弱p21的表達(dá)，從而降低p53和p21啟動子連接，促進(jìn)p53導(dǎo)致核小體重新分布而發(fā)生染色體重塑。此外BRD7基因作為一個其它蛋白轉(zhuǎn)錄輔助因子參與Ras/MEK/ERK和Rb/E2F途徑的調(diào)節(jié)[1]。因此BRD7不僅參與p53調(diào)控，也參與細(xì)胞周期管理基因的調(diào)節(jié)。

圖1 BRD7在不同組織中的表達(dá)情況（SP法；A、C、E×100；B、D、F×400）。A、B：BRD7在正常肺組織中低表達(dá)；C、D：在鱗癌中高表達(dá)；E、F：在腺癌中高表達(dá)。Fig 1 The expression of BRD7 in different tissues (SP method; A, C, E×100; B, D, F×400). A and B: low expression of BRD7 in normal lung tissue; C and D:high expression in squamous cell carcinoma tissue; E and F: high expression in adenocarcinoma tissue.

本研究對NSCLC的病理標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測，首次方便、快速、高效地檢測了BRD7在NSCLC中的表達(dá)，并探討其與肺癌患者性別、年齡、吸煙情況、組織類型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及臨床分期的關(guān)系，從而進(jìn)一步探討B(tài)RD7在肺癌中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)BRD7在NSCLC癌組織中有較高陽性表達(dá)率，說明BRD7在NSCLC中的表達(dá)具有較高的敏感性。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BRD7在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡、吸煙情況、組織類型及分化程度無關(guān)，提示BRD7靶點(diǎn)的NSCLC治療有較廣泛的適宜人群。BRD7在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，不同TNM分期中BRD7的陽性表達(dá)率隨著分期的升高而升高，提示BRD7可以作為針對促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的在體標(biāo)志物。許多研究[7-10]表明，BRD7可促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動、粘附及遷移，在細(xì)胞生長、生存、轉(zhuǎn)化中也具有重要作用，提示BRD7可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

研究[12]發(fā)現(xiàn)人類腫瘤的半數(shù)都發(fā)生p53的突變，且突變多發(fā)生在外顯子5-8。當(dāng)p53基因發(fā)生突變時其介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，DNA合成程序紊亂，發(fā)生遺傳不穩(wěn)定性及多倍性，也可能使p53介導(dǎo)的凋亡喪失而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。突變的p53基因不僅抑癌活性喪失，而且具備促進(jìn)癌癥發(fā)生的作用，p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變成癌基因。p53基因突變是肺癌中發(fā)生頻率最高的遺傳改變。Mechanic等[13]研究表明p53基因突變譜的不同可能影響到肺癌的易感性以及相應(yīng)腫瘤形成的結(jié)論。BRD7與p53有交互作用，被認(rèn)為是腫瘤抑制基因。BRD7在NSCLC中出現(xiàn)高表達(dá)，可能是由于BRD7基因突變，而使BRD7正常的蛋白功能喪失，因此雖然在肺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)的趨勢，但是實(shí)際已經(jīng)喪失了抑制腫瘤功能，這種表達(dá)模式與p53類似。

BRD7與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系，深入研究BRD7基因?qū)τ诹私夥伟┑陌l(fā)生、發(fā)展具有重要意義。BRD7在肺癌細(xì)胞中是否存在突變以及存在哪些位點(diǎn)的突變，尚需要進(jìn)一步的深入研究。

表1 BRD7的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between BRD7 expression and clinicopathological characteristics of non-small cell lung cancer