Artemin的研究進展

尋廣蘇 郭峰杰 綜述 李志剛 周清華 審校

盡管肺癌外科治療技術和多學科綜合治療等有了很大的進步，肺癌總的治愈率仍僅為10%-15%，而I期肺癌的5年生存率可達80%以上。其主要原因是缺乏有效的早期診斷手段和治療腫瘤轉移的有效方法。惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移是一個極其復雜的多階段、多步驟的過程，早期診斷和早期治療是提高患者生存率和降低死亡率的關鍵[1]。Artemin（ARTN）屬于膠質細胞源性神經營養因子配基家族，可介導各種類型神經元的存活、分化和遷移。ARTN及其受體（GFRα3/RET）在惡性腫瘤細胞中表達升高，并參與了各種惡性腫瘤的進展[2]。對ARTN的臨床研究或許能對腫瘤的早期診斷和早期治療提供幫助；對其信號轉導和功能性研究或將為惡性腫瘤的靶向治療開辟道路。

1 ARTN的分子結構

GDNF（glial cell line-derived neurotrophic factor）、NTN（neurturin）和PSP（persephin）被發現后，研究者試圖尋找GDNF家族的其它成員。1998年12月Baloh等[3]發現了GDNF家族的第4個成員。他們以成熟NTN蛋白順序為標準，通過高含量基因組順序（high throughput genome sequences, HTGS）數據庫發現兩個細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）克隆含有與GDNF、NTN及PSP相似但不相同的同源開放閱讀框（homologous open reading frame, hORF），表達序列標簽（expressed sequence tag, EST）數據庫表明該hORF為一種表達基因，利用PCR方法也擴增到與該hORF相關的鼠基因組DNA，并利用cDNA末端的隨機擴增（random amplification of cDNA ends, RACE）技術從人及鼠的組織cDNA文庫擴增到全長的cDNA順序，經分析全長cDNA，表明hORF編碼的是一種新的GDNF家族成員，即ARTN。人ARTN基因有3個外顯子和2個內含子，位于染色體1p32-33區，ARTN蛋白一級結構與GDNF、NTN、PSP相似，相對位置具有相同的7個保守的半胱氨酸殘基，全長約3.9 kb，經不同剪切形成4種mRNA，其大小分別為1,408 bp、1,892 bp、1,162 bp和1,161 bp。人ARTN基因開放閱讀框分別編碼237個、228個及220個氨基酸的前體蛋白，前體蛋白N端為信號肽，由39個氨基酸組成，其后為前體區，在202位存在1個N-糖基化位點（NSTW），在RXXR（RAAR）識別位點處經蛋白酶切割后加工成113個氨基酸序列的成熟ARTN蛋白。其氨基酸順序與NTN和PSP更接近，約45%同源，與GDNF同源性約36%。

2 ARTN的表達分布

成年和發育中的大鼠，其紋狀體、皮層、小腦、海馬和脊髓中都有ARTN少量存在；在成人的紋狀體、皮層、海馬和脊髓中也檢測到ARTN mRNA；另外，新生大鼠中樞神經系統以外的組織如腎、肺、心、脾、肝、血液、坐骨神經、睪丸、卵巢、皮膚、骨骼肌、腎上腺都有ARTN mRNA微量表達。ARTN在體內廣泛分布，提示它們對于神經系統和非神經組織的發育及生理功能的維持具有重要意義[4,5]。

ARTN mRNA在體內分布廣泛，ARTN mRNA分布介于GDNF、NTN與PSP之間。體外試驗[6]表明，成人外周組織中垂體、胎盤、氣管高水平表達，在胎兒中只有腎、肺高水平表達；成人及胎兒腦組織，包括基本神經節（下丘腦核、豆狀核、黑質）及丘腦表達水平都很低，提示ARTN可能作用于皮層下運動系統；脊髓及背根神經節表達量也低，經過14天的大鼠胚胎（E14）的進一步研究表明，在神經根（不包括背根神經節）及腸系膜上動脈周圍高表達，提示ARTN對于外周神經系統的作用可能有兩種方式：對于背根神經節發育中的神經元以旁分泌方式起作用和對腸系膜上動脈等自主神經支配組織起到靶源性因子的作用。

ARTN在人類的各種正常組織和相應組織來源的惡性腫瘤中都有分布，并且呈差異性分布。應用Oncomine數據庫分析人類不同組織來源的癌細胞中ARTN的表達水平，并且與其組織來源相同的正常組織中的ARTN表達水平相比，研究[2]發現，在一些常見癌腫（包括肺癌、卵巢癌、宮頸癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、精原細胞瘤、白血病）中ARTN表達升高，總體趨勢是惡性腫瘤組織比相應正常組織高表達。

3 ARTN的信號轉導

ARTN是分泌性蛋白，這決定了其對細胞的營養作用必須通過跨膜信息傳遞作用即受體介導才能實現。復合受體由兩部分組成，第一部分是糖基化的磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol, GPI）錨定到細胞表面的蛋白分子，稱為GDNF家族受體α（GDNF family receptor alpha, GFRα）直接與GDNF結合；另一部分為原癌基因c-ret編碼的產物蛋白Ret，它是一種跨膜的受體酪氨酸激酶。前者特異性地結合GDNF家族成員，促使Ret磷酸化，磷酸化的Ret激活其下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）等，導致一系列胞內途徑的激活，從而發揮GDNF家族神經營養因子的生理功能[7,8]。GDNF家族各成員的Ret是一樣的，但GFRα有所不同，其特異性是由前者決定的[9]。

3.1 GDNF家族受體 目前的研究表明GFRa至少有4種，即GFRα1、GFRα2、GFRα3和GFRα4。Jing[10]用125I標記的GDNF篩選新生大鼠視網膜細胞的cDNA表達文庫，得到1個2,138核苷酸的cDNA片段，從302核苷酸處開始編碼468氨基酸的多肽，命名為GFRα。多肽的N-疏水端有19個氨基酸的分泌性信號肽，C-端有20個氨基酸的疏水區，由于缺乏親水結構使其與膜磷酯酰肌醇相偶聯。用放射性標記的大鼠GFRα cDNA篩選人黑質cDNA文庫，獲得了人GFRα cDNA其編碼的多肽長465氨基酸，與大鼠有93%的同源性。GFRα3是ARTN的受體，其表達與GFRα1和GFRα2不同，表達部位有嚴格限制性，主要見于外周神經系統如背根節、三叉神經節、交感節和神經纖維鞘細胞以及非神經元細胞（腎上腺嗜鉻細胞、腸上皮細胞）等，中樞神經系統中未見表達[11]。而GFRα1和GFRα2廣泛表達于中樞神經系統和外周器官[11,12]。GFL結合到特異性的GFRα決定了受體復合物的信號特異性，ARTN優先結合于GFRα3，但這種結合的特異性并不是絕對的，如ARTN可以和GFRα1結合[13]。

3.2 Ret-復合受體 由于GFRα是GPI連接的胞外蛋白，缺乏跨膜區及膜內區，無法單獨完成信號傳導。神經營養因子與GFRα特異結合之后，尚需一種跨膜蛋白的介導，信號才能進一步傳入細胞內，這種跨膜蛋白即Ret蛋白，它與GFRα協同作用，共同參與GDNF家族神經營養因子的信號傳導。原癌基因c-ret編碼的產物Ret蛋白是一種受體酪氨酸激酶，它與GFRa共同構成GDNF家族神經營養因子的功能性復合受體。Ret分子最初是作為一種癌基因被發現的，其激活性突變與人甲狀腺癌，II型家族性內分泌瘤胞（MENII）的發生相關，失活性突變則引起Hirchsprung病（無神經結性巨結腸）。Ret分子的胞外有鈣粘附素（Cadherin）樣結構、半胱氨酸富集區，胞內有酪氨酸激酶區，有14個酪氨酸殘基，其中第905位、1,015位、1,062位、1,096位為磷酸化的酪氨酸殘基，分別為生長因子受體結合蛋白（Grb）7/10、PLC、Shc/Enigma、Grb2等蛋白結合位點，其中PLC通過IP3引起胞內鈣釋放，其它則參與Ras-MAPK-CERB信息通路，Grb2還可能參與PI3K-AKt活動[7]。NBL-S細胞系可表達Ret，與ARTN作用后，Ret酪氨酸磷酸化水平升高，用PIPLC處理后，則ARTN引起的Ret磷酸化水平明顯下降，加入可溶性的GFRα3后，又明顯升高；免疫沉淀及Western blot進一步表明，GFRα與Ret在細胞表面形成一個功能性的受體復合物，前者特異性地結合GDNF家族成員，后者進行跨膜信息轉導。可見，GDNF家族神經營養因子結合GFRα后，導致Ret酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的Ret引起下游激酶如MAPK、PI-3激酶等的激活，從而將信息傳遞到細胞內，發揮GDNF家族成員的生理功能[3,7,14]。

4 ARTN在神經系統中的生理功能

ARTN對多種神經元的存活和分化起作用，ARTN可促進培養的中腦多巴胺能神經元形態分化，在多巴胺能神經元結構發育和可塑性中起到重要作用[15,16]。應用Western blot技術和免疫組織化學方法對胎兒及成人組織進行檢測，結果表明ARTN可促進成人海馬神經元的存活，并對維持其功能起作用[17]。在體外培養中，經ARTN處理的頸動脈體血管球細胞的數量增多、胞體增長，這說明ARTN對頸動脈體的功能起作用，并有可能通過頸動脈體轉運提高其神經定向分布[18]。通過對11.5日孕齡（E11.5）到出生后7日（P7）小鼠的研究[19]發現，ARTN在交感神經節神經元軸突發育早期階段對誘導突觸生長起作用，而GDNF和NTN在發育較晚階段對交感神經節神經元軸突定向生長有重要作用。ARTN還可對交感神經元分化、存活和生長起作用，促進E12到E14交感神經元的分化[20]。ARTN對培養的大鼠中腦GABA能神經元和血清素激活神經元也具有明顯作用[21]。雖然在大鼠胚胎中腦腹側未檢測到ARTN表達，但經體外培養的多巴能神經元試驗表明，ARTN也能促進多巴胺能神經元的存活[22]。

ARTN、GDNF和NTN在體外均能促進多種發育中的外周神經元包括交感神經元、副交感神經元及感覺神經元的存活。首先，對頸上神經節交感神經元具有營養與支持作用；其次，也能促進多種神經元如背根神經節、三叉神經節感覺神經元存活，在這兩群感覺神經元中，ARTN促進存活的神經元數量比GDNF、NTN多；另外，對鼻根神經節、內臟感覺神經元的促進存活能力相當。而PSP對于外周神經系統不起作用[3,6,23]。

ARTN能促進運動神經元的存活。腰段脊髓切面乳劑放射自顯影技術顯示，大鼠坐骨神經的運動神經元軸突能以特異的受體介導方式逆向運轉ARTN到神經元胞體，實驗證實，GDNF、NTN和PSP也能以同樣的方式運轉到神經元胞體，這些結果說明GDNF家族成員對運動神經元具有作用[24]。實驗結果表明PSP對運動神經元的存活作用比ARTN、GDNF、NTN等三個因子作用要小得多。

5 ARTN在腫瘤中的研究進展

5.1 ARTN與乳腺癌 ARTN在人類乳腺癌中的表達可使腫瘤細胞惡性程度增加[25]。ARTN廣泛表達于人類乳腺癌細胞系中，上調ARTN在乳腺癌細胞中的表達可將提高乳腺癌細胞的非貼壁生長，增加軟瓊脂和三維基質膠中腫瘤細胞群落的形成數量；促進形成分散生長的腫瘤細胞的表型，增加乳腺癌細胞的轉移和侵襲特性。上調ARTN的表達水平還將增加腫瘤的大小。在異種移植模型中發現，上調ARTN的表達水平將強化高增殖、低分化和高侵襲性的乳腺癌腫瘤細胞的惡性特性。Oncomine[2]數據庫分析顯示，較高的ARTN的表達水平與乳腺癌化療后殘余癌灶的轉移、復發、死亡呈正相關。ARTN蛋白在65%的乳腺癌患者中表達，它的表達明顯降低了這一類患者的總體生存率；通過人為干涉ARTN mRNA的轉錄過程或用其抗體阻斷其在乳腺癌細胞的內源性表達和拮抗其生理功能，將降低乳腺癌細胞的轉移性和侵襲性。可見，ARTN在人類乳腺癌細胞中具有致癌源性，因此抑制ARTN的生理功能是乳腺癌靶向治療中應當考慮的因素。

ARTN是一個雌激素誘導基因，基因數據庫的表達分析顯示，在人乳腺癌中ARTN的基因表達與雌激素受體的表達呈正相關[26]。在雌激素受體陽性的乳腺癌患者中，ARTN的高表達明顯降低群體生存率。在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中，上調ARTN的表達將促進雌激素受體的轉錄，提高雌激素的表達水平，進一步增強對他莫西芬和氟維斯群的藥物抵抗。ARTN的表達增強細胞對他莫昔芬和氟維斯群的抵抗是通過增加bcl-2的表達來實現的。反之，通過阻斷ARTN mRNA的表達或通過ARTN的抗體阻斷ARTN的功能，則增加了雌激素抵抗效力。在對他莫昔芬敏感的乳腺癌細胞中，他莫昔芬降低了ARTN的表達；同樣在他莫昔芬抵抗的乳腺癌細胞中，ARTN的表達升高。用抗體抑制ARTN表達可提高對他莫昔芬抵抗的乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性，因此在乳腺癌細胞中功能性拮抗ARTN的功能可作為一個輔助治療去強化雌激素抵抗效應。

雖然ARTN的表達水平在正常組織和乳腺癌組織中差異不大，有研究[27]發現在乳腺癌中ARTN明顯比在其它類型的癌中高表達（P＜0.001）；從不典型導管增生到乳腺癌的形成過程中，ARTN的表達逐漸升高（P＜0.042）；ARTN在乳腺基底瘤比頂質瘤和網狀瘤高表達[28]；在侵襲性導管癌比乳腺原位導管癌高表達[29]；乳腺癌從I期到III期ARTN的表達逐漸升高[30]（r=0.274）；另外ARTN的表達與雌二醇受體和孕體酮受體正相關。三份獨立研究報告[31-33]表明乳腺癌雌二醇受體陽性的比陰性的ARTN高表達；二份獨立研究報告[33,34]顯示乳腺癌孕體酮受體陽性比陰性細胞的ARTN表達高；男性乳腺癌細胞比女性乳腺癌細胞的ARTN表達高[35]；HER2/neu （c-erbB-2）陽性的乳腺癌腫瘤細胞比陰性細胞的ARTN表達低[31,32]。

ARTN的表達升高多提示乳腺癌的復發或預后不良。一份研究報告[36]顯示乳腺癌復發并雌二醇受體陽性的患者明顯比生存長于5年的患者ARTN表達高；二份研究報告[37,38]顯示預后不良的患者比有生存長于5年的患者ARTN高表達；患者有遠處轉移的明顯比沒有遠處轉移的ARTN高度表達[38]；對化療敏感的患者明顯比化療不敏感的患者ARTN低表達（P＜0.001）；所有患者[31,38]中乳腺癌雌二醇受體陽性比陰性ARTN高表達（P＜0.005）；因此ARTN在乳腺癌中的表達水平與患者的預后有明顯的相關性。GDNF的表達譜在人類各種癌癥和正常組織中的對比分析也被Oncomine數據庫分析，相比ARTN，其缺乏疾病與預后的相關性。

有免疫組織化學分析法對ARTN在乳腺癌中的表達情況分析示[25]：乳腺癌細胞中ARTN比正常乳腺組織細胞高表達（P＜0.001），ARTN的表達高低與年齡、腫瘤大小、淋巴結有無轉移、臨床分期、雌激素受體狀態和孕酮受體狀態無關，與HER2/neu （c-erbB-2）的表達高低呈正相關。

5.2 ARTN與胰腺癌 胰腺導管腺癌以局部神經改變和外周神經從侵襲著稱，導致嚴重疼痛和妨礙完整切除癌腫手術的完成。ARTN神經營養蛋白控制神經元生長、再生、存活，可用于分析胰腺導管腺癌和神經轉移之間的相互關系。用蛋白印記分析和免疫組織化學分析對ARTN和它的受體（GFRα3/RET）在胰腺導管腺癌和正常胰腺中的表達情況分析[39]：ARTN及其受體在胰腺導管腺癌中比正常胰腺組織中ARTN表達高，主要集中在肥大的神經、動脈壁、原位癌灶和轉移癌灶中。通過定量逆轉錄PCR對胰腺癌組織、正常胰腺組織和胰腺癌細胞系中ARTN mRNA的表達分析，去評估ARTN是否影響癌細胞的增殖和侵襲：ARTN高表達提升胰腺癌細胞的侵襲能力近5倍，ARTN是趨神經因子似乎增進胰腺癌沿神經的侵襲，也促進了癌細胞沿著胰腺神經向遠處轉移。MTT生長分析和三維基質膠實驗被應用以評估癌細胞增殖情況與ARTN表達的關系，結果示ARTN的表達高低對癌細胞的增殖沒有影響。在胰腺導管腺癌中組織的ARTN表達水平與患者的疼痛并不相關。

有研究[40]采用免疫組化和RT-PCR方法檢測胰腺癌組織、癌旁組織和正常胰腺組織中ARTN GFRα3的表達，結果顯示胰腺癌組織中ARTN、GFRα3陽性表達率分別為72.09%和67.44%，均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），癌旁組織中ARTN、GFRα3僅出現在動脈平滑肌細胞中，在胰腺內神經叢和導管未見明顯表達。在胰腺癌組織中ARTN、GFRα3在神經、癌細胞中均有較強表達：ARTN、GFRα3在有神經浸潤的胰腺癌組織中陽性表達率明顯高于無神經浸潤者，其差異有統計學意義。以上證明了ARTN、GFRα3與胰腺癌細胞的生物學行為有關，他們之間的相互作用可能促進了胰腺癌細胞侵襲能力，直接導致癌細胞侵至胰腺內外神經叢，這與Veit等[41]的結果一致。有研究[42]也顯示，胰腺癌中ARTN mRNA明顯高于正常胰腺組織，有神經浸潤的胰腺癌組織也明顯高于無神經浸潤的胰腺癌組織，但ARTN mRNA增高的水平遠低于蛋白的增高水平，可能是因為胰腺外神經叢產生的ARTN蛋白也聚集于胰腺內神經叢。密集的神經網絡和肥大的神經不僅在胰腺癌中存在還在正常的癌旁組織中存在，而在正常胰腺中很少見或不常見。但是在組織學正常的胰腺癌旁組織或胰腺癌中的出現可能與胰腺內的神經轉移密切相關。利用胰腺癌、癌旁組織或胰腺癌細胞株懸浮提取物培養腸肌神經叢明顯增加了神經突的數量。當去除ARTN后培養，神經突的密度明顯降低[42]。看似正常的癌旁組織很可能已通過神經趨化因子轉移，盡管沒有證實神經與癌的交互作用導致了微轉移。胰腺癌的神經介導轉移作用可以在體外建模模擬，進一步揭示了ARTN很可能在胰腺癌的神經轉移中扮演重要角色。

有資料[3]顯示，ARTN蛋白主要產生于背根神經節。癌細胞持續損傷神經纖維，促進背根神經元產生大量ARTN蛋白，用于修復保持被損傷神經纖維的完整性，ARTN蛋白沿神經軸突逆向輸送至胰腺內神經叢，導致胰腺內ARTN蛋白的表達明顯高于其mRNA表達水平。總之，ARTN和GFRα3在胰腺癌中的表達及其相互作用能誘導和促進胰腺癌神經浸潤轉移，這將有助于進一步明確胰腺癌神經浸潤轉移的發生機制。同時可能通過對ARTN、GFRα3的表達調控或基因轉染方法，與其它化療、放療等方法共同干預胰腺癌細胞內環境和宿主微環境，達到抑制胰腺癌浸潤轉移、改善胰腺癌預后的目的。

5.3 ARTN與食管癌 有研究[43]結果顯示ARTN在食管癌中的表達水平明顯高于正常食管組織，而且在不同臨床病理分期之間表達差異有統計學意義（P＜0.01），實驗結果表明，在食管癌中隨著疾病的進展，ARTN陽性表達率也逐漸升高，在發生淋巴結轉移的食管癌中ARTN的陽性表達率也明顯高于未發生淋巴結轉移的食管癌組織（P＜0.01），提示ARTN的陽性表達可能與食管癌的淋巴結轉移相關。

基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2,MMP2）是一類內肽酶，能夠降解細胞外基質成分，生理狀態下參與組織的重構和傷口的愈合。在腫瘤的形成過程中能夠降解基底膜而促進腫瘤的侵襲、轉移，還能夠促進毛細血管的生成，促進腫瘤的生長和擴散[43,44]。O-charoenrat等[45]研究發現MMP2的激活能夠通過p53介導的SCCRO引起腫瘤細胞的浸潤和轉移。有研究[43]表明MMP2的表達與ARTN呈正相關，ARTN與MMP2同時陽性表達的病例數明顯高于兩者同時陰性表達的病例數，數據統計分析顯示ARTN與MMP2之間存在明顯的相關性。李紅梅等[46]的研究結果顯示：轉移能力相對較高的細胞系產生的MMPs的能力強于轉移能力相對較低的細胞系，兩項研究結果相一致。結果顯示兩者的聯合表達可能與食管癌的疾病進展、侵襲和遠處轉移有密切的聯系。Kolb等[47]研究發現重組表達ARTN能促進癌細胞的浸潤，利用RNA干擾劑阻斷ARTN的表達后，胰腺癌細胞的浸潤能力下降，在食管癌中的研究目前未見報道，進一步研究ARTN在腫瘤發生發展中的作用，將有助于我們設計合理的靶向治療藥物，對食管癌的生物治療提供理論基礎。

5.4 ARTN與子宮內膜癌 已有研究[48]證實在對子宮內膜癌用阿霉素和紫杉醇化療時，聯合應用ARTN的功能性抗體，將降低子宮內膜癌細胞的增殖性和侵襲性。因此，針對ARTN的靶向治療或許是子宮內膜癌很有前景的治療方法。目前，已經證實在子宮內膜癌中CD24是經過介導ARTN的功能來抵抗阿霉素和紫杉醇的，很有可能CD24是啟動相關基因的中間產物。在 RL95-2細胞株ARTN和CD24均能啟動相關基因，如CCND1、BCL2、AKT1、TWIST1和VIM，并降低BAD和PLAU的mRNA表達。功能性抑制ARTN的功能，將增加子宮內膜癌對阿霉素和紫杉醇的敏感性。因此，用ARTN的功能性抑制抗體拮抗其功能，對子宮內膜癌的治療是有效的，無論是抑制腫瘤細胞的侵襲性還是提高其對化療藥的敏感性。在子宮內膜癌中ARTN通過上調CD24的轉錄增加其表達，因此它們的表達具有相關性。在子宮內膜癌CD24的高表達將增加癌細胞的增殖、侵襲和降低對阿霉素和紫杉醇的敏感性。拮抗CD24的表達將消除經過ARTN激活的對阿霉素和紫杉醇的抵抗。因此，在子宮內膜癌中ARTN的高表達將提升對阿霉素和紫杉醇的抵抗，這是通過CD24的特殊調節過程來實現的。功能性抑制ARTN和CD24的表達可以被認為是一個有效的輔助治療，來增加子宮內膜癌對化療藥的敏感性。

在子宮內膜癌中ARTN的表達量比正常子宮內膜組織明顯增加，并且ARTN的表達水平與子宮內膜癌的分期和侵襲性呈正相關。在子宮內膜癌細胞中增加ARTN的表達可以縮短細胞循環周期和提高細胞的存活率，因此可以明顯增加總的細胞數量。此外，上調ARTN的表達明顯增加子宮內膜癌細胞的非貼壁生長。在上調ARTN移植模型中，癌細胞表現出高增殖、低分化、高侵襲的特性。ARTN的表達上調增加致癌性和侵襲性是通過增加AKT1的表達來實現的[49]，在子宮內膜癌細胞中對ARTN mRNA的阻斷和用抗體對其的功能性阻斷都將明顯降低其癌源性和侵襲性。因此，阻斷ARTN基因轉錄過程和拮抗其生理功能將成為子宮內膜癌的治療策略，以延緩其進展。

5.5 ARTN與肺癌

5.5.1 ARTN及其受體在人類肺癌中的表達情況 Oncomin數據庫[2]對人類的肺癌細胞基因的表達進行研究，發現ARTN、GFRA1-A3和RET在正常肺組織和肺腫瘤細胞中的表達存在差異。為了檢測ARTN在肺癌中的表達情況，本實驗室對載有腺癌35例、鱗癌33例、大細胞癌9例、小細胞癌12例和正常肺組織10例的組織芯片進行免疫組化分析，以檢測ARTN在不同肺癌組織中的表達情況（圖1）。免疫組化示ARTN在正常肺組織、非小細胞肺癌和小細胞肺癌中都有不同程度的表達；相比于正常的肺組織，ARTN在類癌、非小細胞肺癌（腺癌和鱗狀細胞癌）和小細胞癌中的表達水平明顯升高。ARTN的高表達與鱗狀細胞癌細胞去分化密切相關，可以提高肺部鱗狀細胞癌的臨床分期，促進鱗狀細胞癌的進展。相對于肺癌的其它亞型來說，ARTN在鱗狀細胞癌中表達最高。Bild[33]曾指出：ARTN在鱗狀細胞癌中的表達水平比在腺癌中高出96%。GFRA1在肺癌各個亞型中的表達水平是不一樣的，還沒有準確的證據說明GFRA1的高表達能促進腺癌進展。相比于正常肺組織，GFRA2在惡性腫瘤（除類癌）的表達水平明顯降低，GFRA2在鱗狀細胞癌中表達預示著高分化、鱗狀細胞肺癌早期。GFRA3的表達水平在類癌、腺癌、鱗癌和小細胞肺癌中明顯比正常肺組織中高；Ret的表達水平在腺癌中明顯比在人類正常肺組織中高。相對于肺癌的其它亞型（鱗癌、大細胞癌、小細胞癌）來說，腺癌細胞RET明顯高表達。

我們采用半定量RT-PCR和Western blot分別對8株非小細胞肺癌細胞株NL9980、L9981、95D、LTEP-α-2、SPCA-1、YTLMC-9、PC-9和A549進行檢測，結果如（圖2A、圖2B）所示。半定量RT-PCR和Western blot示：ARTN在細胞株 LTEP-α-2、SPCA-1、YTLMC-9、PC-9比在細胞株NL9980、L9981高表達。另外，有研究[50]顯示：ARTN、GFRA3和RET的RNA在非小細胞肺癌細胞株H1299、H1975、H460、H2009和A549細胞系中均檢測表達，它們的表達水平不同；GFRA成員在各個細胞系中表達差異很大：GFRA1僅在H1299、H460和A549 細胞系中檢測到，GFRA2 卻在 H1975 和A549細胞系中檢測到。

圖1 免疫組化法檢測肺癌組織中ARTN的表達。A：正常肺組織（×100）；B：鱗癌（×100）；C：腺癌（×100）；D：小細胞肺癌（×100）；E：大細胞肺癌（×100）；F：鱗癌（×200）；G：腺癌（×200）和H：小細胞肺癌（×200）。Fig 1 The status of ARTN expression in lung cancer cells by immunohistochemistry. A: normal lung tissue (×100); B: squamous cell carcinoma (×100); C: adenocarcinoma (×100); D: small cell lung carcinoma (×100); E: large cell lung carcinoma (×100); F: squamous cell carcinoma (×200); G:adenocarcinoma (×200); H: small cell lung carcinoma (×200).

圖2 RT-PCR/Western blot檢測ARTN mRNA（A）/蛋白（B）在9種肺癌細胞株中的表達Fig 2 The relative express level of ARTN expression in eight NSCLC cell lines by RT-PCR (A)/Western blot (B)

5.5.2 ARTN的高表達提高H1299細胞的增殖、轉移和侵襲能力 Tang[50]轉染了非小細胞肺癌細胞系H1299，用一個編碼人類ARTN基因的（pIRESneo3-ARTN）質粒和一個空的媒介質粒pIRESneo3，分別產生了穩定H1299-ARTN和H1299-VEC細胞系，并用實驗證實H1299-ARTN細胞中ARTN的表達水平明顯高于對照組H1299-VEC細胞。在10%胎牛血清培養基中單層培養實驗中，沒有觀察到H1299-VEC和H1299-ARTN細胞數目存在差異。定量PCR分析也沒能發現因相關基因改變細胞周期而導致的增殖差異。然而，他們觀察到在低血清的培養基（0.2%FBS）中，H1299-ARTN的細胞數目比H1299-VEC細胞數目多48%。PI染色和流式細胞儀分析并未發現H1299-VEC和H1299-ARTN細胞在細胞周期各階段分布情況中存在明顯不同，只是觀察到有不同的細胞總數，或許歸因于不同細胞的固有凋亡比率。在紫杉醇用于治療非小細胞肺癌的臨床用藥試驗中[51]，通過紫杉醇誘導H1299-細胞凋亡模型，流式細胞儀分析和PI染色分析測定H1299-ARTN的早期、晚期和總體細胞凋亡率分別為48%、57%和54%，明顯低于H1299-VEC細胞。

Tang[50]檢測了ARTN高表達對H1299非貼壁生長的影響，對于一種轉化的細胞表型，這是一個特征性生理標志。在軟瓊脂上H1299-ARTN形成的細胞集落比H1299-VEC細胞多出91%。在三維基質膠培養中H1299-ARTN的細胞數比H1299-VEC多61%。在細胞懸浮培養實驗中，H1299-ARTN的細胞數目比H1299-VEC多82%。在三維基質膠中，H1299-ARTN形成的球形細胞群落具有星狀散射的形態，并且明顯比H1299-VEC多。H1299-ARTN在三維基質膠中表現出較強的生長能力和擴散形態，因此ARTN很可能提高了非小細胞肺癌的侵襲能力。

在轉移性分析中，H1299-ARTN細胞株的轉移細胞比H1299-VEC細胞多131%。在劃痕試驗中H1299-ARTN細胞明顯比H1299-VEC細胞修復劃痕的速度快。在侵襲性分析中，H1299-ARTN細胞通過轉孔侵襲的數目比H1299-VEC細胞多128%。定量PCR顯示，TGFB1在H1299-ARTN細胞中的表達水平明顯比H1299-VEC細胞升高，被認為是非小細胞肺癌的侵襲刺激因子[52]。

5.5.3 在異種移植模型中ARTN高表達增強了腫瘤細胞的惡性特性 用H1299-ARTN細胞構建的老鼠異種移植腫瘤模型，檢測在模型中ARTN的高表達對腫瘤細胞特性的影響[50]。用皮下注射的方法將H1299-ARTN細胞和H1299-VEC細胞分別注射到有免疫缺陷的老鼠的肩胛下區域，第30天，H1299-ARTN細胞衍生腫瘤比H1299-VEC細胞衍生的腫瘤明顯增大，增大比例約63%。他們通過檢測腫瘤細胞的溴脫氧尿苷來計數細胞進入S期的比率，合用TUNEL染色在腫瘤的每個部分檢測腫瘤細胞的凋亡情況，檢測結果顯示：H1299-ARTN細胞衍生腫瘤進入S期的細胞比H1299-VEC細胞衍生腫瘤多45%，而凋亡比率則降低了37%。組織病理學檢測發現H1299-VEC細胞衍生的腫瘤是有規則的腫瘤細胞形成的局限性腫瘤，它們與周圍組織有著清晰的分界。然而H1299-ARTN細胞衍生的腫瘤是較松散的腫塊，有些地方有空泡形成，這些區域聚集很多大的多形細胞，這些細胞表現出形態極不規則，具有多重深染的細胞核和大部分細胞質，與周圍組織邊界不清，并表現出粘蛋白的特征。同時還觀察到，H1299-ARTN衍生腫瘤細胞還向神經纖維靠近生長，預示著具有外周神經侵襲特性。在H1299-ARTN衍生腫瘤所在老鼠的肺中，還發現轉移結節（2/6），但是并沒有在H1299-VEC細胞衍生腫瘤所在的老鼠中發現（0/6）。Tang[50]同樣轉染了非小細胞肺癌細胞系H1975，分別產生了穩定H1975-ARTN和H1975-VEC細胞系。ARTN的高表達同樣提高了H1975細胞存活率、轉移和侵襲能力。因此，ARTN在非小細胞肺癌中的高表達預示著腫瘤細胞具有更高的增殖和存活率，并由此引發腫瘤的快速生長和高侵襲，并最終導致遠處轉移。

5.5.4 ARTN經過BCL2介導增強非小細胞肺癌細胞的惡性程度 研究[50]發現抗細胞凋亡因子BCL2 mRNA表達水平在高表達ARTN的腫瘤細胞中明顯升高。與其對應的對照組H1299-VEC/H1975-VEC相比，在H1299-ARTN細胞中BCL2 mRNA表達水平升高165%；H1975-ARTN細胞BCL2 mRNA的水平升高356%。此外，他們還發現高表達ARTN可激發BCL2啟動子活性：H1299-ARTN細胞BCL2啟動子活性比H1299-VEC細胞高49%；同時H1975-ARTN細胞BCL2啟動子活性比H1975-VEC細胞高383%。Western blot分析結果與以上是一致的；進一步揭示了H1299-ARTN和H1975-ARTN細胞中的BCL2蛋白表達水平均比它們相應的對照組增高。他們把H1299-VEC和 H1299-ARTN細胞經過BCL2抑制劑YC137[53]處理后，在數量和形態上評估上述細胞在軟瓊脂和三維基質膠的生理狀態。在H1299-VEC細胞中YC137產生一個劑量依賴性降低軟瓊脂集落形成的作用。YC137可以明顯消除由ARTN刺激強化的H1299-ARTN細胞的非貼壁生長，這些都證明ARTN在軟瓊脂中促進細胞集落的形成是依賴BCL2介導的。此外，YC137明顯地降低了H1299-ARTN細胞由ARTN刺激引起的在三維基質膠中的生長速度，即使在H1299-VEC細胞中，通過抑制BCL2的表達也一樣降低了該細胞的生長速度。

5.5.5 抑制或阻斷ARTN可降低非小細胞肺癌細胞惡性程度 有研究[50]通過小干擾RNA內源性拮抗ARTN在兩個非小細胞肺癌細胞系的表達，并檢測其對細胞功能影響結果。他們構建轉染篩選了穩定的H1299-siARTN/H1299-CONTROL和H1975-siARTN/H1975-CONTROL細胞系，靶向拮抗了ARTN的內源性表達，同時與相應陰性對照組對比研究。半定量RT-PCR和 Western blot分析顯示，H1299-siARTN和H1975-siARTN細胞株的ARTN mRNA和ARTN蛋白的表達明顯比它們相應的對照組H1299-CONTROL和H1975-CONTROL細胞株降低。H1299-siARTN細胞與H1299-CONTROL細胞比較：降低ARTN表達的H1299-siARTN細胞降低32%細胞集落形成，降低54%細胞轉移，降低49%細胞侵襲，降低31%在三維基質膠中的生長速度。同樣，相似的結論在H1975-siARTN細胞和H1975-CONTROL細胞比較中得到。他們在非小細胞肺癌細胞系中用抗ARTN抗體功能性抑制ARTN的作用，進一步評價ARTN的生理功能[50]。把H1299細胞和H1975細胞系分別用雞ARTN單克隆抗體（ARTN-IgY）處理，并將它們設為實驗組。用預免疫的雞單克隆抗體（CONIgY）處理的細胞作為相應的陰性對照組；用軟瓊脂集落試驗和三維基質膠生長試驗來檢測兩組細胞生理功能的差異。用ARTN-IgY處理過的H1299細胞，在軟瓊脂中的集落比對照組明顯縮小23%；在三維基質膠生長試驗中這些差別得到了重現。另外，H1299細胞經過ARTN-IgY處理后，該細胞相比于對照組細胞轉移性降低45%，侵襲能力降低48%。在H1975細胞經過ARTN-IgY處理后，與對照組H1975ARTN-CON-IgY相比，在軟瓊脂和三維基質膠中的生長、侵襲和轉移能力均有不同程度的降低。總體來說，細胞存活率也降低，有相當大比例的H1975-ARTN-IgY細胞在軟瓊脂和三維基質膠生長試驗中停止生長，并漸漸消失。

5.5.6 ARTN受體表達情況對肺癌細胞生理特性的影響ARTN在H1299肺癌細胞株中的表達相對于肺癌細胞株H1975來說并不高。然而在肺癌細胞株H1299和肺癌細胞株H1975中去除或抑制ARTN的表達對該細胞生理功能的影響是相似的。一些特殊細胞對配體的反應并不單純取決于配體的濃度，如一些配體完全激動受體信號環路僅僅只需占據5%的受體[54]。還需要指出H1299表達GFRα3和GFRα1兩種受體，而H1975細胞株僅僅表達GFRα3受體。ARTN已被證實刺激GFRα1-RET復合體的形成，這是需要GFRα3受體參與的[55]，因此H1299細胞株同時有GFRα3和GFRα1兩種受體。相對于只能表達GFRα3一種受體的H1975細胞株，在ARTN較低濃度可以對各種功能反應有良好的應答。膠質細胞源性神經營養因子配體已被證實可以結合非GFRα蛋白[56,57]，功能不依賴于RET的參與。因此，在不同的非小細胞肺癌細胞株中ARTN的表達水平并不能預測它的致癌性水平的相對高低。

在大多數惡性肺部腫瘤中，ARTN和受體GFRα3被檢測到都有不同程度的升高，包括類癌、腺癌、鱗狀細胞癌（非小細胞癌的兩個主要亞型）和小細胞癌。此外，GFRα3在人和老鼠的正常肺和支氣管中被檢測出來[58,59]，RET也被證實在人的正常肺中表達。這些事實進一步說明在人的肺中存在著ARTN自分泌的功能性信號轉導途徑，過度地激活此信號轉導途徑可以促進肺癌的進展；或放大和增加大多數其它癌基因的表達，包括表皮生長因子受體等，已有報道存在于一些肺癌的亞型[60]。

5.5.7 ARTN與肺癌的預防、治療和預后 Oncomine數據庫顯示ARTN的表達與肺癌患者的吸煙行為有極強的相關性；因此，我們在同是鱗狀細胞癌患者中檢測到了ARTN表達具有巨大差異；然而在并不吸煙的患者中，ARTN的表達在各個非小細胞肺癌的亞型中仍然是升高的，比如腺癌，這是在非吸煙肺癌患者中檢測到的主要的亞型；還有類癌和小細胞肺癌中ARTN的表達相比于正常的肺組織也是升高的。

在上調ARTN的表達移植模型中，將導致形成大量空泡多核腫瘤細胞，這些腫瘤細胞微觀上觀察很像巨細胞癌，這種情況預示著腫瘤將出現獨特的快速生長，遠處廣泛的轉移，術后伴隨著高復發的風險，并表現出對現有化療方案的不敏感和很差的預期壽命，相對于其它類型的非小細胞肺癌亞型來說[61,62]。

ARTN介導了非小細胞肺癌的進展，原因可能歸結于ARTN在腫瘤的微環境中所起的旁分泌作用[63]。調高ARTN的表達，將增加非小細胞肺癌的侵襲性和轉移性，同時也增加了TGFB1的表達。在原發性肺癌中，TGFB1表達的升高常常伴隨著轉移性的增加，這也提示腫瘤的高復發率和高死亡率[52,64]。

已有研究證實在非小細胞肺癌細胞中ARTN的致癌性是通過升高BCL2的表達來實現的。在各種人類惡性腫瘤細胞中BCL2表現出增進細胞增殖和提高細胞存活率的作用，包括肺癌[65,66]。在活體中ARTN的升高很可能是促進了BCL2的高表達，由此產生了一個致癌優勢。增加BCL2的表達應先提高ARTN的表達，這些在人乳腺細胞和子宮內膜細胞中已被觀察到[49,63,67]，抑制ARTN的表達用于降低非小細胞肺癌細胞的致癌性是可以期待的。

直到現在，還沒有觀測到BCL2的表達與非小細胞肺癌化療敏感性存在相關性。盡管如此，BCL2似乎參與到人肺癌細胞株對化療藥物耐受的過程之中[68-70]，聯合應用ABT-737（BCL2家族的藥理抑制劑），在非小細胞肺癌細胞株中增強了紫杉醇和吉非替尼的細胞毒性[71,72]。ABT-737和ABT-263不僅作為一個獨立因素提供良好的臨床前效能，而且明顯地增進了人類小細胞肺癌和非小細胞肺癌細胞株的凋亡，并且增強了從這些細胞衍生的異形腫瘤對放療和化療的敏感性，使其退化消亡[73]。當前，ABT-263正在小細胞肺癌的患者中進行臨床試驗[73]。鑒于ARTN對紫杉醇有抵抗優勢，因此抑制ARTN的表達用于提高非小細胞肺癌對化學的敏感性是可以期待的。

6 展望

ARTN的結構、分布、信號轉導途徑及對惡性腫瘤的發生、發展的作用具有其獨特的一面。在治療相關疾病的臨床應用中可能較其它家族成員具有更好的應用前景。隨著人類基因組計劃的研究進展，遺傳信息數據不斷豐富，ARTN的功能表達的生理機制將被進一步明確，這將有助于為神經系統疾病，惡性腫瘤的靶向治療提供理論依據，從而為神經系統疾病和惡性腫瘤的基因治療及藥物開發奠定基礎。