miR-145通過下調OCT4基因抑制肺腺癌干細胞增殖

張帥 武雅琴 馮冬杰 張治 蔣峰 尹榮 許林

已有研究[1]證明腫瘤組織中存在一類具有干細胞樣潛能的腫瘤發生細胞,它們可能是腫瘤發生、復發和耐藥的關鍵,因而被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs).當前,如何遏制CSCs的增殖潛能是腫瘤學領域的研究熱點.新近研究[2]證明,CD133+非小細胞肺癌細胞具有自我更新能力,是肺癌干細胞(lung cancer stem cells, LCSCs)的表面標志之一.

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度約22個核酸的非編碼內源性小RNA,可以與基因mRNA的3'UTR區結合,起到在轉錄后水平調控基因表達的作用,已有研究[3]表明其在調控腫瘤分化、發生、浸潤及轉移等多個環節發揮重要作用,對未來腫瘤治療可能產生革命性影響,因而受到廣泛重視.我們基于臨床肺腺癌組織標本,通過miRNA芯片初篩及qPCR驗證發現:腫瘤較正常組織miR-145表達下調明顯,提示其是一種潛在的"保護性"miRNA.生物信息學軟件預測調控干細胞的關鍵基因OCT4是其可能的靶基因,本研究旨在闡明miR-145在調控LCSCs增殖中的作用及可能的分子機制.

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞株 miRNA表達譜分析采用美國LC Science公司μParafloTMmicroRNA微流體微陣列芯片.miRNA提取試劑盒mirVana RNA Isolation Kit,逆轉錄試劑盒Taqman miRNA Reverse Transcripation Kit,熒光實時定量PCR試劑盒Taqman Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG和內參RNU6B MGB探針標記的引物購于美國ABI公司.miR-145模擬物Pre-miR-145 mimics、阻遏物Anti-miR-145 inhibitor、miR-145模擬物陰性對照Pre-miR-145 mimics negative control和阻遏物陰性對照Anti-miR-145 inhibitor control購于美國ABI公司.轉染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司.肺腺癌A549及用于轉染質粒載體的Hela細胞株購于中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫,RPMI1640培養基購于Hyclone公司,胎牛血清購于Gibco公司.OCT4、β-actin一抗購于Abcam公司,HRP標記的二抗購于北京中杉金橋生物科技有限公司,CD133一抗購于Cell Signaling Technology公司,FITC標記的二抗購于美國KPL公司.雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司.CCK-8試劑盒購于南京凱基生物有限公司.

1.2 miRNA表達譜分析 隨機選擇臨床上10例肺腺癌患者的手術標本,男女比例為1:1.Trizol法提取樣品總RNA,通過YM-100(Millipore)微離心過濾柱得到片段小于300 nt的小RNA,參照Sanger 13.0 miRNA數據庫,進行μParafloTMmiRNA微流體微陣列芯片檢測.雜交檢測使用Cy3和Cy5特異性熒光標記、激光掃描儀(GenePix 4000B,Molecular Device)采集雜交圖象、Array-Pro(Media Cybernetics)軟件對雜交圖像進行數字化轉換.數據處理和分析首先是扣除背景,計算重復點平均值和標準偏差,然后通過LOWESS(Locally-Weighted Regression)過濾進行標準化.在10例標本中,共同上調或下調P<0.01的差異表達miRNA被初篩用以進一步研究.

1.3 miRNA的real time PCR相對定量檢測 檢測對象為20例隨機選擇的的肺腺癌患者腫瘤及瘤旁正常組織標本及在轉染后48 h收獲的細胞樣品,RNA的提取、逆轉錄和PCR反應均嚴格按照ABI公司提供的Taqman miRNA assay的方法,以RNU6B作為內參進行相對定量,每組設置3個復孔,在 ABI 7500實時定量熒光PCR儀機器檢測.

1.4 生物信息學軟件靶基因預測 應用在線生物信息學miRNA靶基因預測軟件miRanda(網址http://www.miRBase.org/)對miR-145的靶基因進行預測.

1.5 細胞培養和轉染 肺腺癌A549細胞株培養在RPMI1640培養液+10%胎牛血清中,溫度37oC,CO2濃度5%.將A549細胞分為5組,即miR-145模擬物轉染組,阻遏物轉染組,模擬物陰性對照轉染組,阻遏物陰性對照轉染組和只加轉染試劑的空白對照組.轉染在六孔細胞培養板內、待細胞結合度約50%-70%時進行,每孔板加入25 pmol的模擬物和10 μL的轉染試劑,使模擬物的終濃度為10 pmol/mL,轉染后5 h換液.

1.6 Western blot蛋白水平檢測 在轉染后48 h收獲細胞,以β-actin為內參,步驟按照常規方法,見文獻[4].采用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析.

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測 克隆擴增OCT4基因的3'UTR區的全長,引物序列:forward primer 5' GGTGCCTGCCCttCTAGGAATG3',reverse primer 5' TAAGTGTGTC-TATCTACTGTGT3',重組到psiCHECK-2,生物信息學預測mir-145與OCT4基因的靶結合位點,并針對該點進行定點突變,表達海腎熒光素酶的pRL-TK載體用來作為內參照調整細胞數量和轉染效率的差異,miR-145模擬物以及陰性對照和miR-145阻遏物及其陰性對照分別和火螢熒光素酶報告載體共轉染進入Hela細胞,雙熒光素酶活性檢測嚴格按照Promega提供的方法[5].

1.8 細胞增殖活力檢測 采用CCK-8方法檢測轉染細胞的增殖活力,分別在轉染1 d-6 d內檢測.細胞接種在96孔板內,每孔內加入5,000個細胞,100 μL培養液和10 μL檢測試劑.于添加CCK-8試劑2 h后上酶標儀在450 nm處檢測各孔OD值,每組重復4次.相對增殖活力=處理組OD值/空白對照組OD值.

1.9 流式細胞術檢測CD133+表型 在轉染后72 h收獲細胞,采用間接標記方法.流式細胞儀為FACS Calibu(美國BD公司),分析軟件為Flowjo 7.6版本.

1.10 統計學方法 統計軟件采用SPSS 13.0版本.數據結果以均數±標準差的方式顯示,多組間均數比較采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05認為有統計學差異,數據圖表采用Graphicpad Prism 5.0軟件制作.

2 結果

2.1 miRNA芯片表達譜分析及real time PCR驗證 經過PCR驗證,共有9個miRNA在腫瘤組織中表達明顯下調(包括miR-126、miR-223、miR-451、miR-145、miR-26b、miR574-5p、miR26b、let-7b、let-7c,P<0.05),除已有研究的let-7家族和miR-126等miRNA外,miR-145的表現引人關注,miR-145在幾乎所有患者腫瘤組織中均明顯下調(P<0.01),且70%患者差異表達3倍以上(圖1).

圖 1 Real time PCR對芯片分析的驗證結果.圖中各組miRNA表達數值為Log2(正常組織/腫瘤組織),其中miR-145在幾乎所有患者腫瘤組織中均顯著下調(P<0.01).Fig 1 Real time PCR validation of miRNAs screened by microarray

2.2 生物信息學軟件預測 通過對miRNA數據庫的查詢,找到miR-145的成熟序列和其種子序列,運用在線預測軟件miRanda對其靶基因進行分析,其中OCT4為其可能的靶基因(圖2).

2.3 Real time PCR檢測各組miR-145的表達水平 miR-145模擬物轉染組的miR-145表達明顯上調,是空白對照組的13.78±0.38倍(P<0.001),阻遏物轉染組miR-145的表達水平明顯下調,是空白對照組的0.11±0.01倍(P<0.001),陰性對照組與空白對照組之間的miR-145表達無明顯統計學差異(圖3).表明miR-145模擬物明顯促進了A549細胞中miR-145的表達,而miR-145阻遏物則明顯抑制miR-145的表達.

2.4 OCT4蛋白水平 miR-145模擬物轉染組和miR-145阻遏物轉染組中OCT4蛋白表達較其他三組有明顯差異,OCT4蛋白在模擬物轉染組中表達明顯下調,而在阻遏物轉染組中表達明顯上調(圖4).說明miR-145可能抑制OCT4蛋白的表達.

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測 對miR-145和OCT4的野生型結合位點進行定點突變.miR-145模擬物和野生型OCT4共轉染組的Hela細胞熒光素酶活性下降約50%(P<0.001),而突變型轉染組中熒光素酶活性無明顯變化,同時在miR-145阻遏物和陰性對照組中也未觀察到有熒光素酶活性的改變(圖5),統計分析顯示差異無統計學意義.該結果表明miR-145可以直接調控OCT4基因.

2.6 細胞在轉染后1 d-6 d內的增殖活力 如圖5所示,細胞在轉染miR-145模擬物后增殖活力變強,在轉染miR-145阻遏物后增殖緩慢(P<0.01,圖6),其他三組增殖活力差異無明顯統計學意義(P<0.01).同時細胞增殖活性改變在轉染后3 d-4 d時表現最明顯.該結果表明miR-145可以抑制A549細胞的增殖.

圖 3 Real time PCR檢測各轉染組miR-145的表達情況.圖中以空白對照組(Blank)為基準,表達水平為1.00.**P<0.001 vs 空白對照組.Fig 3 The expression of miR-145 in each group determined by real time PCR. The blank group was considered as baseline and its value was 1.00.**P<0.001 vs blank group.

圖 4 Western blot檢測各轉染組的蛋白水平Fig 4 OCT4 protein level determined by western blot

圖 5 雙熒光素酶報告基因檢測結果.**P<0.001.Fig 5 Dual-luciferase reporter gene assay. **P<0.001.

圖 6 CCK-8試驗檢測細胞增殖活力Fig 6 Cell proliferation assay by CCK-8 kit

圖 7 流式細胞儀檢測CD133+表型細胞的比率.*P<0.05 vs miR-145模擬物陰性對照組;#P<0.01 vs miR-145阻遏物陰性對照組.Fig 7 CD133+ cell ratio analyzed by flow cytometer. *P<0.05 vs miR-145 mimics control group; #P<0.01 vs miR-145 inhibitor control group.

2.7 CD133+表型分析 如圖7所示,CD133+細胞的比率在miR-145模擬物組為4.53%±0.37%,與模擬物對照組6.50%±0.92%相比明顯降低(P<0.05);而miR-145阻遏物組為9.86%±1.50%,與阻遏物對照組6.62%±0.74%相比明顯升高(P<0.01);miR-145模擬物組與miR-145阻遏物組亦明顯降低(P<0.01).表明miR-145可明顯抑制LCSCs的增殖.

3 討論

miRNA是現今腫瘤學的研究熱點之一,能與多種靶基因結合且具有可預測性的特點尤其吸引人們的注意.越來越多的文獻[7]表明miRNA可以作為一項工具來調控與腫瘤發生發展有關的信號通道和一些關鍵基因或因子,并將與腫瘤有關的這一類miRNA稱為oncomir.目前,與肺癌相關的miRNA研究已取得了一些進展,但目前明確對肺癌發生發展具有調控作用的miRNA仍需繼續發掘,因此采用高通量技術篩選與肺癌相關的差異miRNA,對其進行功能學研究仍十分必要.

參照Sanger 13.0 miRNA數據庫,我們隨機選取肺腺癌患者組織標本進行了miRNA表達譜分析以及real time PCR驗證,篩選出17種腫瘤與正常組織相比具有明顯表達差異的miRNA,例如let-7家族、miR-126和miR-145等明顯下調,這與Yanaihara等[8]的研究結果相似.除已有研究的let-7家族和miR-126等miRNA外,miR-145的表現引人關注,miR-145在幾乎所有患者腫瘤組織中均明顯下調.為深入研究肺癌中miR-145的作用,我們通過文獻檢索發現:雖已有報道[9]在乳腺癌中miR-145表達顯著下調,并可抑制乳腺癌細胞增殖,但miR-145在肺癌中的生物功能學研究尚未見報道.因此,我們利用TargetScan、mi-Randa等在線分析軟件,來預測miR-145可能的下游靶基因,發現其中包含維持干細胞自我更新特性的關鍵基因之一OCT4[10].在胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES)研究[11]中,miR-145可調控OCT4等控制細胞自我更新潛能的關鍵轉錄因子基因,從而抑制ES的分化;而OCT4等ES特異性標志在各種實體腫瘤中亦呈現高表達,在肺癌中OCT4的表達越高,預后越差[12].因此OCT4等核轉錄因子可能是抑制CSCs無限分化潛能的關鍵基因.

為了闡明miR-145和OCT4基因之間的關系,我們對體外生長的肺腺癌A549細胞株進行miRNA模擬物和阻遏物的轉染分別促進和抑制miR-145的表達,運用western blot和雙熒光素酶報告基因的技術從蛋白和基因兩個水平來驗證兩者之間靶向調節作用,最終證明miR-145可以直接調控OCT4基因.我們的研究還表明miRNA與靶基因的結合具有相對特異性,miR-145對于野生型的OCT4基因具有顯著的調控的作用,但對于突變型的OCT4基因卻未表現出靶向調控作用.

我們通過細胞增殖實驗對轉染miR-145的A549細胞進行功能學研究發現,過表達的miR-145可以抑制A549細胞的生長,因此我們進一步在機制方面進行了探索.目前,腫瘤干細胞學說的提出為人們對腫瘤基礎研究和臨床干預提供了一條新的思路,鑒定、分離和靶向調控干細胞成為研究熱點.鑒于OCT4基因在人類干細胞分化中扮演的重要角色,Chen等[13]研究也證明OCT4基因的表達是維持CD133+表型特征的原因之一.因此,其表達的變化也會影響CSCs的分化.我們針對LCSCs特異性表面標志CD133進行了流式細胞術檢測,以此來評價LCSCs的增殖狀況.研究結果表明miR-145可以明顯地調節A549細胞株中CD133+表型細胞的比率,而這種作用的實現很可能是通過miR-145對OCT4基因的調控來實現的.

綜上,通過調控干細胞自我更新關鍵基因OCT4從而抑制LCSCs增殖可能是miR-145抑制肺腺癌生長的重要機制.由于CSCs是腫瘤發生發展的惡性源頭,如果能調控甚至逆轉腫瘤干細胞的生長分化必將對腫瘤的治療帶來深遠影響.因此,本研究為肺癌的生物學防治提供了一個新的潛在靶標.