Src蛋白在肺癌細胞增殖浸潤中的作用

鄭銳 秦曉松 李文潔 康健

肺癌是世界范圍腫瘤相關性死亡的主要病因,近年來肺癌藥物治療的新策略轉向抑制腫瘤生長進展中特異性通路和關鍵分子的分子靶向治療[1].其中,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼已成功地用于治療某些晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者,然而也只是部分腺癌患者更有效[1,2].因此,有必要加強對其它重要的靶分子的研究.

Src是最早報道的癌基因,反轉錄病毒基因V-Src具有致癌性,其同源的原癌基因C-Src是人或動物細胞中的正?；?它們編碼相對分子質量為6X104的非受體蛋白酪氨酸激酶[3].Src蛋白質產物由N端、Src同源域、激酶域和C端組成,Src蛋白在調控細胞的生存、增生、黏附、運動和細胞信號轉導等方面發揮重要作用[4].人類很多腫瘤都存在Src蛋白的過度表達和/或活化,Src蛋白在腫瘤的發生、發展和轉移中具有重要作用[5,6].近來研究發現Src蛋白在肺癌中也有過度表達和/或活化[6-8],體外實驗和臨床研究[6,7]表明抑制Src酪氨酸激酶對肺癌患者有效,然而其在肺癌進展中的作用及機制尚不清楚,本文研究Src蛋白在6種不同類型的肺癌細胞中的表達和活化,進而探討Src蛋白在肺癌細胞增殖浸潤中的作用.

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品和設備 人支氣管上皮細胞BEAS2B,人肺腺癌A549細胞和RERFLCOK細胞購于美國模式培養物保藏所;人肺腺癌PC-9細胞和小細胞肺癌SBC5細胞購于日本IBL公司;人肺腺癌PC14PE6細胞和鱗癌H226細胞為美國德州大學安德森癌癥中心所贈.選擇性Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉衍生物由英國AstraZeneca公司提供.鼠抗Src單克隆抗體購自Upstate Biotechnogy公司.兔抗Src(酪氨酸418)磷酸特異性多克隆抗體購自Biosource International公司.增強型化學發光(enhanced chemiluminescence ECL)試劑盒購自Amersham Pharmacia Biotech公司.溴化二甲噻唑二苯四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium, Mtt]購自美國Sigma公司.膠原I購自BD Biosciences公司.纖維聯結蛋白:日本巖城硝子公司.

1.2 細胞培養 BEAS2B細胞在含10%小牛血清的LHC9/RPMI-1640培養基中,A549細胞、PC-9細胞、H226細胞和RERFLCOK細胞在含10%小牛血清的DMEM培養基中,PC14PE6細胞和SBC5細胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培養基中,于37oC、5%CO2飽和濕度培養.每毫升培養液含100 U青霉素、100 μg鏈霉素.

1.3 Western blot和免疫沉淀法檢測Src蛋白在肺癌細胞中的表達和活化 首先提取總蛋白,將43-45代BEAS2B細胞以及對數生長期的6種肺癌細胞接種于10 cm培養皿上,待細胞長滿培養皿的80%時,用PBS洗兩次,加入細胞裂解緩沖液,于干冰上速凍.待細胞溶解后,用塑料刮匙收集裂解液,低溫超聲粉碎,離心20 min(16,000 r/min, 0oC),用Bradford蛋白分析試劑測量所提取蛋白的濃度.

對于免疫沉淀,取500 μg蛋白上清用鼠抗Src單克隆抗體孵育過夜(4oC),然后用蛋白G-瓊脂糖珠在旋轉臺上孵育2 h(4oC),用溶解緩沖液反復清洗4次.取100 μg蛋白或之前清洗過的免疫沉淀物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉移蛋白到硝酸纖維素膜上,于5%的小牛血清白蛋白緩沖液中阻斷1 h,用鼠抗Src單克隆抗體或兔抗Src(酪氨酸418)磷酸特異性多克隆抗體孵育過夜(4oC),接下來于物種特異性的辣根過氧化物酶鏈接的二抗中孵育1 h,洗滌用ECL顯示免疫反應條帶,用Image J軟件進行圖像分析處理,計算灰度值及相對強度.

1.4 Western blot和免疫沉淀法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對Src蛋白在肺癌細胞中的表達和活化的影響 將各種肺癌細胞接種于6孔板上,待細胞長滿培養皿的80%時,給予不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑處理60 min,然后提取總蛋白,進行免疫沉淀和Western blot,具體步驟同上.由于Src酪氨酸激酶抑制劑對Src蛋白在肺癌細胞中的表達沒有明顯影響,我們把Src蛋白在肺癌細胞中的表達作為內對照.

1.5 MTT法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對肺癌細胞體外增殖的抑制作用 肺癌細胞(PC-9、A549、H226、PE14PE6和RERFLCOK)2X104/mL接種于96孔板,37oC、5%CO2培養箱孵育24 h后,每孔加入不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑(0.01 μM、0.03 μM、0.1 μM、0.3 μM和1 μM)0.1 mL,設置細胞對照及空白對照,每組樣本設6個復孔,置37oC、5%CO2培養箱孵育72 h后,每孔加入50 μL MTT(2 mg/mL),繼續培養2 h,去掉培養液,加入100 μL DMSO,充分振蕩溶解深藍色結晶,于MTP-120微孔板酶免比色儀下測定吸光度值,550 nm和630 nm分別為檢測和參考波長.最終計算3次實驗的平均值[9].

1.6 Boyden chamber方法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對肺癌細胞侵襲浸潤的抑制作用[9]使用膠原I(30 μg/filter)包埋孔徑為8 μm的transwell chambers.血清饑餓24 h的肺癌細胞(1X105/200 μL)懸浮于含有不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑(0.01 μM、0.03 μM、0.1 μM、0.3 μM和1 μM)的培養液中,加到槽的上層.含有10 μg/mL纖維聯結蛋白的趨化液加到槽的下層.置37oC、5%CO2培養箱孵育6 h后,用棉棒擦掉沒有浸潤到下層的細胞,切下分隔膜,使用Diff-Quik系統進行固定和染色.在200X亮視野顯微鏡下隨機選取6個視野計數細胞數,取3個獨立實驗的平均值進行統計學分析.在進行侵襲浸潤實驗的同時,用MTT法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對細胞生存活力的影響.

1.7 統計學方法 采用SPSS 11.0統計分析軟件進行方差分析,P<0.05為有統計學差異.

2 結果

2.1 Src蛋白在肺癌細胞中的表達和磷酸化

2.1.1 Src蛋白在肺癌細胞中的表達 研究發現人正常支氣管上皮細胞BEAS2B,人NSCLC細胞(PC-9、A549、PC14PE6、RERFLCOK和H226)和人小細胞肺癌SBC5細胞中都存在pp60src的表達.pp60src在A549細胞中的表達水平略高于BEAS2B細胞中的表達,在PC-9細胞中的表達和BEAS2B細胞接近,而在其余的人肺腺癌、鱗癌和小細胞肺癌細胞中的表達均明顯低于BEAS2B細胞.pp60src在人小細胞肺癌SBC5細胞中的表達水平約為人正常支氣管上皮細胞BEAS2B的38%(圖1).

圖 1 肺癌細胞中Src蛋白的表達和磷酸化.A:肺癌細胞中Src蛋白的表達和磷酸化的Western blot檢測結果;B:肺癌細胞中Src蛋白的表達和磷酸化的分析圖.Fig 1 Expression and phosphorylation of Src in lung cancer cells. A: Expression and phosphorylation of Src in lung cancer cells by Western blot; B: The analysis of expression and phosphorylation of Src in lung cancer cells.

2.1.2 Src蛋白在肺癌細胞中的磷酸化 BEAS2B細胞中Src蛋白呈現弱的自主磷酸化(SrcpY418),NSCLC細胞中Src蛋白的自主磷酸化水平明顯增高,PC-9細胞中的SrcpY418水平為人正常支氣管上皮細胞BEAS2B中的2.1倍;A549細胞中SrcpY418水平為BEAS2B中的1.7倍;H226、PC14PE6和RERFLCOK中SrcpY418水平也分別為正常的1.4、1.3和1.2倍.然而在人小細胞肺癌SBC5細胞中幾乎檢測不到SrcpY418水平(圖1).

2.2 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞中Src蛋白表達和磷酸化的作用 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞中pp60src的表達沒有抑制作用,pp60src作為內對照.RERFLCOK、H226和PC14PE6細胞對Src酪氨酸激酶抑制劑不敏感,≤1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對RERFLCOK細胞中SrcpY418水平幾乎無影響,≥0.3 μM的Src酪氨酸激酶抑制劑才能夠抑制H226和PC14PE6細胞中SrcpY418水平.而0.03 μM Src酪氨酸激酶抑制劑使PC-9和A549細胞Src蛋白的自主磷酸化(SrcpY418)降低50%以上,Src酪氨酸激酶抑制劑對PC-9和A549細胞SrcpY418呈現明顯的劑量依賴的抑制作用(圖2).

圖 2 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞中Src蛋白表達和磷酸化的作用Fig 2 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on Src expression and phosphorylation in nonsmall cell lung cancer (NSCLC) cells

2.3 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞增殖的抑制作用 0.01 μM-1 μM 5種濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑作用于NSCLC細胞72 h后,MTT法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞體外增殖的抑制作用.Src酪氨酸激酶抑制劑對5種NSCLC細胞體外增殖呈現出不同的反應.≤1 μM的Src酪氨酸激酶抑制劑對H226、PC14PE6和RERFLCOK細胞增殖沒有明顯的抑制作用.Src酪氨酸激酶抑制劑對PC-9和A549細胞表現出明顯的劑量依賴性抑制作用.0.1 μM、0.3 μM和1 μM的Src酪氨酸激酶抑制劑對PC-9細胞和A549細胞增殖的抑制率分別為53.6%(P<0.001)、72.2%(P<0.001)和82.4%(P<0.001);以及30.3%(P<0.05)、38.5%(P<0.001)和46.6%(P<0.001)(圖3).

圖 3 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞體外增生的影響.與對照組相比,*P<0.05,***P<0.001.Fig 3 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on NSCLC cell proliferation. *P<0.05,***P<0.001 vs control group.

2.4 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞體外侵襲浸潤的影響 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞呈現明顯的劑量依賴性抑制作用.特別是PC-9細胞對Src酪氨酸激酶抑制劑非常敏感,0.03 μM、0.1 μM、0.3 μM和1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對PC-9細胞體外侵襲浸潤的抑制率分別為17.3%(P<0.05)、63.5%(P<0.001)、82.7%(P<0.001)和91.7%(P<0.001).0.3 μM和1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對A549細胞體外侵襲浸潤的抑制率分別為36.4%(P<0.001)和77.9%(P<0.001).1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6細胞和H226細胞體外侵襲浸潤也表現出明顯的抑制作用,抑制率分別為54.7%(P<0.001)和36.9%(P<0.001).同時進行的Mtt分析說明侵襲浸潤實驗所用的藥物濃度和時間對NSCLC細胞活力無明顯影響(圖4,圖5).

圖 4 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞體外侵襲浸潤的影響Fig 4 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on NSCLC cell invasiveness

圖 5 Src酪氨酸激酶抑制劑對NSCLC細胞體外侵襲浸潤的影響.與對照組相比,*P<0.05,***P<0.001.Fig 5 Effect of Src tyrosine kinase inhibitor on NSCLC cell invasiveness. *P<0.05, ***P<0.001 vs control group.

3 討論

人類很多腫瘤都涉及到原癌基因的異常表達和活化.雖然大多數原癌基因產物的生物化學功能還不是很清楚,它們當中的一些原癌基因產物具有蛋白酪氨酸激酶活性,其中pp60src是研究最廣泛的蛋白激酶.肺癌、乳腺癌、結腸癌和胰腺癌等很多腫瘤都存在Src蛋白的過度表達和/或活化[5,10].

本研究發現,NSCLC中Src蛋白的活化和Src蛋白的表達不同步.本實驗所用的5種NSCLC細胞都存在Src蛋白的表達和活化,但是Src蛋白的表達水平無明顯增加,只有肺腺癌A549細胞的Src蛋白水平略高于正常支氣管上皮細胞中的水平,肺腺癌PC-9細胞中的Src蛋白水平與正常接近,而其余的肺腺癌細胞PC14PE6、RERFLCOK和肺鱗癌H226中Src蛋白的表達都明顯低于正常水平.與之相反的是,NSCLC中Src蛋白的自主磷酸化(SrcpY418)水平都高于正常支氣管上皮細胞,特別是腺癌中Src蛋白的自主磷酸化水平明顯高于正常.這與Masaki等[8]學者的研究結果是一致的.此外,Rosen等[11]也發現和正常乳腺組織相比,乳腺腫瘤的Src激酶活性明顯增高,而Src蛋白的表達相對正常.因此可以推測,在NSCLC中,Src激酶活性增高不是或不完全由于Src蛋白表達的增加.Src蛋白的活化,而不是過度表達,可能在NSCLC進展過程中發揮更重要的作用.

NSCLC中Src蛋白活化的方式是多種多樣的[6,7].本研究發現,人NSCLC中正常調節自主磷酸化位點酪氨酸418(SrcpY418)的直接磷酸化明顯增高.另有報道[12],肺腺癌中存在Src蛋白酪氨酸530的解磷酸化.此外,Src作為胞漿內蛋白,能與細胞膜上的許多生長因子受體相互作用,進而激活Src蛋白[6].激活的Src蛋白使其下游信號發生瀑布效應,通過組織絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)以及信號傳導和轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信號通路促進腫瘤細胞增殖和轉移;通過血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和上皮基質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促進腫瘤新生血管形成、浸潤和轉移[13].研究[8]表明,肺腺癌中Src蛋白活化程度和腺癌腫塊的大小相關,說明Src蛋白的活化能促進肺腺癌增殖和進展.

前期的研究[9,14]發現,抑制Src酪氨酸激酶自主磷酸化,能夠抑制肺腺癌細胞的體內外增殖和體外浸潤.在此基礎上,本研究進一步探討了Src酪氨酸激酶抑制劑對5種不同的NSCLC細胞的作用.結果表明,亞微摩爾Src酪氨酸激酶抑制劑抑制Src自主磷酸化,滅活Src蛋白,能夠明顯抑制Src蛋白自主磷酸化水平較高的肺腺癌PC-9和A549細胞的體外增殖和浸潤.1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6和H226細胞的游走浸潤也有明顯的抑制作用,而1 μM Src酪氨酸激酶抑制劑對PC14PE6、H226和RERFLCOK細胞的增殖則沒有明顯的抑制作用.因此,活化的Src蛋白在NSCLC細胞體外增殖和浸潤中發揮著重要作用,同一腫瘤的不同類型,Src蛋白對細胞增殖和浸潤的影響可能是不同的[9],Src蛋白自主磷酸化水平較高的NSCLC細胞可能對Src酪氨酸激酶抑制劑更敏感.另一方面,抑制NSCLC體外侵襲浸潤所需的濃度明顯低于抑制細胞增殖所需的濃度,提示Src蛋白調節細胞增殖和浸潤的方式以及信號傳導通路可能是不同的[9].

與NSCLC相反,本研究觀察到小細胞肺癌SBC5細胞中Src蛋白的表達和活化程度都很低,Src蛋白的表達水平僅為正常支氣管上皮細胞的38%,而SrcpY418檢測不出.因此,與Src蛋白在NSCLC,特別是腺癌中的作用相比,Src蛋白在小細胞肺癌進展中的作用有限,這還有待深入研究.

綜上所述,Src蛋白的活化,而不是過度表達,在NSCLC細胞體外增殖和浸潤中發揮著重要作用,其機制有待進一步探討.Src酪氨酸激酶抑制劑可以選擇性用于Src蛋白高度活化的NSCLC的分子靶向治療.