RNA干擾GRP75表達(dá)改善人肺腺癌細(xì)胞對順鉑耐藥性

石思恩 何澤鋒 蔡建春 邱江鋒

目前肺癌已經(jīng)成為我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,大約70%的患者在診斷時(shí)已發(fā)展至晚期,無法通過手術(shù)治愈,故化療成為肺癌綜合治療中的重要部分.但是腫瘤細(xì)胞對化療藥物發(fā)生耐藥常導(dǎo)致化療失敗.近年來,人們對腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制進(jìn)行了深入的研究.我們前期的研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,研究人肺腺癌細(xì)胞A549對順鉑發(fā)生耐藥前后的蛋白質(zhì)表達(dá)變化,觀察到GRP75在耐藥細(xì)胞中高表達(dá)[1].在本次研究中,我們通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默耐藥細(xì)胞中GRP75基因的表達(dá),觀察干擾前后腫瘤細(xì)胞對順鉑敏感性的變化,探討GRP75在肺癌細(xì)胞耐藥機(jī)制中的作用,以期為肺癌的治療發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn),為揭示肺癌的耐藥機(jī)制提供線索,并為尋找逆轉(zhuǎn)耐藥途徑提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC),A549/CDDP細(xì)胞為前期研究中誘導(dǎo)建立[1].主要試劑包括:HyQ RPMI-1640培養(yǎng)液(Sigma公司)、10%優(yōu)級新生牛血清(Gibco公司)、GRP75 shRNA (h) Lentiviral Particles(Santa Cruz公司)、Control shRNA Lentiviral Particles(Santa Cruz公司)、Polybrene(Santa Cruz公司)、兔抗人GRP75多克隆抗體(Cell Signaling公司)、兔抗人bcl-2單克隆抗體(Cell Signaling公司)、兔抗人p53單克隆抗體(Cell Signaling公司)、兔抗人β-actin多克隆抗體(Cell Signaling公司)、胰蛋白酶(1:250,Gibco公司分裝)、順鉑(CDDP,Sigma公司)、DMSO試劑級(Amresco公司)、噻唑藍(lán)(Mtt,Ultra Pure Grade,Amresco公司)、碘化吡啶PI(Sigma公司)、Rnase(Sigma公司)、國產(chǎn)分析純.主要儀器包括:SW-CJ-ZFD型雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、Forma Series II Wcta Jacketed CO2Incubator水套培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation)、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、高速離心機(jī)(日立公司)、熒光顯微鏡(奧林帕斯公司)、Touch Screen F039300酶標(biāo)儀(Sunrise Remote).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549和A549/CDDP細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、200 μg/mL慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37oC、5%CO2孵箱中,在飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液.每4-5天以1:3的比例用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次,調(diào)整細(xì)胞密度不超過5X105個(gè)/mL.

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 將1X104個(gè)A549細(xì)胞接種于24孔板,加入1 mL新鮮培養(yǎng)液,培養(yǎng)生長24 h,當(dāng)50%以上細(xì)胞貼壁后開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染.配制培養(yǎng)液和Polybrene的混合液,混合液中Polybrene濃度為5 μg/mL.室溫下充分解凍GRP 75 shRNA (h) Lentiviral Particles,并輕搖使之均勻.棄去孔中液體,加入1 mL混合液和100 μL慢病毒,輕輕旋轉(zhuǎn)12孔板使之混勻,培養(yǎng)生長24 h后,棄去孔中液體,將孔內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)傳代,將此組細(xì)胞命名為A549/I.按上述相同方法,將Control shRNA Lentiviral Particles轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為A549/C.

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞 按1.2.2所述方法,將GRP 75 shRNA (h) Lentiviral Particles轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為CDDP/I;將Control shRNA Lentiviral Particles轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞命名為CDDP/C.

1.2.4 熒光顯微鏡觀察 以上4組細(xì)胞A549/I、A549/C、CDDP/I、CDDP/C,分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況.

1.2.5 Western blot檢測各組細(xì)胞GRP75、p53、bcl-2表達(dá)轉(zhuǎn)染后7天,取A549、A549/I、A549/C、A549/CDDP、CDDP/I、CDDP/C六組細(xì)胞各一瓶,棄去培養(yǎng)基,以PBS輕柔洗去殘余培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液吹打細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至EP管冰浴,離心后收取上清.然后BCA測定各組蛋白濃度,每組取20 μg蛋白.將各組收集的蛋白樣品與2XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以1:1混合,置于沸水浴加熱5 min,以充分變性蛋白,后置于冰上2 min以冷卻至室溫,行12%SDS-PAGE電泳,預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后停止電泳.電泳完畢后,切膠,使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300 mA-400 mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30 min.轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到洗滌液中漂洗2 min,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液.吸盡洗滌液后,加入20 mL含5%脫脂奶粉的PBST封閉液,室溫下封閉1 h,棄去封閉液.加入按1:500稀釋的兔抗人GRP75多克隆抗體,加入β-actin作為內(nèi)參,4oC孵育過夜,洗滌液洗膜3次,吸盡洗滌液.加入按1:4,000稀釋的、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔二抗,4oC孵育1 h,洗滌液洗膜3次,吸盡洗滌液.蛋白檢測:加入BeyoECL Plus顯色劑,X片曝光,顯影,定影.按以上同樣方法檢測各組細(xì)胞p53和bcl-2蛋白表達(dá).

1.2.6 MTT法檢測各組細(xì)胞順鉑敏感性 分別取A549、A549/I、A549/C、A549/CDDP、CDDP/I、CDDP/C六組細(xì)胞各一瓶,用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,以5X103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,每孔體積200 μL,置于37oC、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后,更換培養(yǎng)液,按組分別加入200 μL含不同濃度順鉑(0、0.025 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL、6.4 μg/mL、12.8 μg/mL)的培養(yǎng)基.每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,并取不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)基孔作為空白對照組,接種細(xì)胞但不加藥物孔作為對照組.48 h后,吸取孔內(nèi)液體,PBS清洗2次,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,溫箱中培養(yǎng)4 h.然后吸取孔內(nèi)液體,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩10 min后,選擇530 nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(optical demsity, OD).根據(jù)每個(gè)藥物濃度組OD值(平均值)計(jì)算細(xì)胞存活率(vital rate,VR):VR(%)=(用藥組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)X100%.通過改良寇式法計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50),公式為:lgIC50=Xm-Ix[P-(3-Pm-Pn)/4].其中Xm=lg最大劑量,I=lg(最大劑量/相臨劑量),P=陽性反應(yīng)率之和,Pm=最大陽性反應(yīng)率,Pn=最小陽性反應(yīng)率.之后計(jì)算各組細(xì)胞耐藥指數(shù)(resistance index, RI),公式為:RI=檢測組IC50/A549組IC50.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間差異分析采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 感染慢病毒的細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下可以觀察到綠色熒光,計(jì)數(shù)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù),其占總細(xì)胞數(shù)的比例即為感染效率,熒光顯微鏡顯示在48 h各組感染效率均已達(dá)到90%以上(圖1).

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞GRP75蛋白表達(dá) Western blot檢測顯示在慢病毒RNA干擾7 d后,各組細(xì)胞中的GRP75蛋白表達(dá).實(shí)驗(yàn)顯示,攜帶GRP75 shRNA的慢病毒干擾A549細(xì)胞后,A549細(xì)胞中的GRP75表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),而不含干擾序列的慢病毒干擾A549細(xì)胞后,A549細(xì)胞中的GRP75表達(dá)無明顯變化(P>0.05).攜帶GRP75 shRNA的慢病毒干擾A549/CDDP細(xì)胞后,A549/CDDP細(xì)胞中的GRP75表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),而不含干擾序列的慢病毒干擾A549/CDDP細(xì)胞后,A549/CDDP細(xì)胞中的GRP75表達(dá)無明顯變化(P>0.05).(圖2A,圖2D).

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞對順鉑敏感性 圖3顯示的是不同濃度的順鉑作用48 h后,A549細(xì)胞、A549/I細(xì)胞、A549/C細(xì)胞、A549/CDDP細(xì)胞、CDDP/I細(xì)胞、CDDP/C細(xì)胞生長受到抑制的情況.在細(xì)胞存活率方面,相同濃度順鉑下,A549/I vs A549、CDDP/I vs A549/CDDP均下降(P<0.05),CDDP/I的下降幅度大于A549/I(P<0.05);而A549/C vs A549、CDDP/C vs A549/CDDP的存活率則無明顯差異(P>0.05).表1顯示經(jīng)過MTT檢驗(yàn)計(jì)算后的各組細(xì)胞對順鉑的IC50和耐藥指數(shù).結(jié)果顯示,在IC50方面,A549/I vs A549、CDDP/I vs A549/CDDP下降(P<0.05),但CDDP/I的IC50仍然高于A549,而A549/C vs A549、CDDP/C vs A549/CDDP則無明顯差異(P>0.05).在耐藥指數(shù)方面,A549/I vs A549、CDDP/I vs A549/CDDP下降(P<0.05),但CDDP/I的耐藥指數(shù)仍然高于A549,而A549/C vs A549、CDDP/C vs A549/CDDP則無明顯差異(P>0.05).

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞p53蛋白表達(dá) Western blot檢測顯示在慢病毒RNA干擾后,各組細(xì)胞中的p53蛋白表達(dá).實(shí)驗(yàn)顯示,A549/CDDP細(xì)胞的p53表達(dá)較A549細(xì)胞明顯下調(diào)(P<0.05);A549細(xì)胞經(jīng)慢病毒RNA干擾后p53表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),而經(jīng)空病毒干擾后p53表達(dá)輕微上調(diào)(P<0.05);A549/CDDP經(jīng)慢病毒RNA干擾后p53表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01),而經(jīng)空病毒干擾后p53表達(dá)輕微上調(diào)(P<0.05)(圖2B,圖2D).

2.5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá) Western blot檢測顯示在慢病毒RNA干擾后,各組細(xì)胞中的p53蛋白表達(dá).實(shí)驗(yàn)顯示,A549/CDDP細(xì)胞的bcl-2較A549細(xì)胞明顯上調(diào)(P<0.05);A549細(xì)胞經(jīng)慢病毒RNA干擾后bcl-2表達(dá)無明顯改變(P>0.05),而經(jīng)空病毒干擾后bcl-2表達(dá)上調(diào)(P<0.05);A549/CDDP經(jīng)慢病毒RNA干擾后p53表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),而經(jīng)空病毒干擾后p53表達(dá)輕微上調(diào)(P<0.05)(圖2C,圖2D).

表 1 各組細(xì)胞對順鉑IC50及耐藥指數(shù)Tab 1 IC50 and RI of six groups of cells to cisplatin

3 討論

圖 1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染48 h A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞熒光圖(X100).A:A549/I;B:A549/C;C:CDDP/I;D:CDDP/C.左為明場,右為暗場.轉(zhuǎn)染率為暗場中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)與明場中細(xì)胞總數(shù)的比值.可以觀察到,各組的轉(zhuǎn)染率均在90%以上.Fig 1 Fluorography of A549 cells and A549/CDDP cells at 48 h after transfection (X100). A: A549/I; B: A549/C; C: CDDP/I; D: CDDP/C. Bright fields on the left and dark fields on the right. Transfection rate is calculated as ratio between green-fluorescent cell count in the dark field and cell count in the bright field. The transfection rates of 4 groups are all above 90%.

圖 2 Western blot檢測各組細(xì)胞GRP75、p53以及bcl-2的表達(dá).A:GRP75;B:p53;C:bcl-2;D:各組細(xì)胞GRP75、p53、bcl-2相對表達(dá)量.Fig 2 Western blot assay of GRP75, p53 and bcl-2. A: GRP75; B: p53;C: bcl-2; D: Relative quantitative of GRP75, p53, bcl-2 in six groups of cells. 1: A549; 2: A549/I; 3: A549/C; 4: A549/CDDP; 5: CDDP/I; 6:CDDP/C.

圖 3 不同濃度順鉑作用48 h各組細(xì)胞存活率Fig 3 48 h vital rate of 6 groups of cell in different concentrations of cisplatin

近年來,RNAi作為一種實(shí)驗(yàn)技術(shù),在關(guān)于腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制,以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥方法的研究中,表現(xiàn)出令人欣喜的成效.Wu等[2]通過siRNA有效地抑制腫瘤細(xì)胞中MDR1的mRNA和P-gp的表達(dá).July等[3]設(shè)計(jì)的凝聚素siRNA可明顯抑制凝聚素的表達(dá),從而增強(qiáng)了體外腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性.Yuan等[4]將mdr1 siRNA轉(zhuǎn)染多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/Adr后證實(shí)特異性siRNA能明顯提高阿霉素對MCF-7/Adr細(xì)胞的殺傷作用,逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性.通過RNAi技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)基因的表達(dá),正在成為克服腫瘤細(xì)胞耐藥的新策略,它為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥提供了一種新的思路,有較好的應(yīng)用前景.

本研究采用攜帶GRP75 shRNA的慢病毒進(jìn)行RNA干擾.在RNA干擾后48 h,通過熒光顯微鏡觀察到,此時(shí)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均已達(dá)到90%以上,超過許多文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾的平均水平,說明了慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾的高效性.在RNA干擾后7天,進(jìn)行Western blot檢測,可以觀察到轉(zhuǎn)染了GRP75 shRNA后的A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞GRP75蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào),說明慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾能長時(shí)間穩(wěn)定地沉默目的基因的表達(dá),并且具有很強(qiáng)的特異性.同時(shí)我們也觀察到,在轉(zhuǎn)染了不帶有干擾序列的慢病毒后,A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞GRP75蛋白的表達(dá)不受影響,說明慢病毒本身并不抑制GRP75蛋白的表達(dá).通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾,我們成功地將GRP75 shRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞,并且GRP75 shRNA有效地抑制了GRP75蛋白的表達(dá).

在確認(rèn)GRP75蛋白的表達(dá)被有效抑制后,我們對六組細(xì)胞進(jìn)行了MTT檢測,以觀察它們在不同濃度的順鉑作用48 h后的存活情況.通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們觀察到,當(dāng)GRP75蛋白的表達(dá)被抑制后,A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的耐受性均降低,說明了GRP75蛋白是A549細(xì)胞對順鉑的耐藥機(jī)制的相關(guān)蛋白.同時(shí),我們觀察到轉(zhuǎn)染了不帶干擾序列的慢病毒后,A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性沒有明顯地改變,說明慢病毒本身并不影響A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性.但是相對于A549/CDDP細(xì)胞耐藥性的較大幅度降低,A549細(xì)胞的耐藥性降低并不明顯.并且我們觀察到,雖然經(jīng)過RNA干擾后,沒有達(dá)到完全封閉GRP75表達(dá)的效果,但是耐藥細(xì)胞中GRP75蛋白的表達(dá)水平已經(jīng)低于敏感細(xì)胞,即使如此,A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性仍明顯地低于A549細(xì)胞.這些結(jié)果表明,GRP75是A549細(xì)胞對順鉑耐藥機(jī)制的相關(guān)蛋白之一,通過抑制GRP75蛋白的表達(dá)可以一定程度上改善A549細(xì)胞對順鉑的耐藥性.

GRP75是一種分布于線粒體和胞質(zhì)內(nèi)的重要的分子伴侶[5],其N端1-23位點(diǎn)為線粒體的穿膜信號,可以幫助蛋白質(zhì)正確折疊,協(xié)助蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn).在細(xì)胞能量代謝過程中GRP75蛋白可以幫助與能量代謝相關(guān)的生物大分子穿過線粒體參與能量代謝的各種反應(yīng).在缺糖、輻射等應(yīng)激條件下,GRP75表達(dá)上調(diào),有提高細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)耐受性的作用,對缺糖造成的細(xì)胞損傷也有明顯的保護(hù)作用.Grp75還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平、調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、處理抗原等生理過程[6-8].另外還有研究[9,10]顯示,GRP75還有抑制細(xì)胞凋亡的作用,可能與其能修復(fù)受損蛋白的功能有關(guān).順鉑的作用機(jī)理是進(jìn)入肺癌細(xì)胞后,與DNA交叉聯(lián)結(jié),形成穩(wěn)定的順鉑-DNA復(fù)合物,阻斷DNA復(fù)制,引起肺癌細(xì)胞死亡,其中凋亡是主要死亡方式.由于GRP75主要定位于線粒體,因此它在對抗順鉑的過程中所起的作用,并不是直接參與了阻止順鉑進(jìn)入細(xì)胞核,或者修復(fù)DNA損傷,更可能是通過抑制細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞獲得更多的修復(fù)時(shí)間,從而得以存活.

野生型p53是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子,其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑包括轉(zhuǎn)錄依賴性途徑和非轉(zhuǎn)錄依賴性途徑.轉(zhuǎn)錄依賴性途徑是當(dāng)細(xì)胞受損時(shí),細(xì)胞內(nèi)野生型p53表達(dá)上調(diào),繼而其下游基因,包括Bax、p53Alpx、P21、mdm2、Fas/Apo-1、Noxa、PERP、DARL、PIDD等[11-13],發(fā)生表達(dá),引起線粒體跨膜電位的改變,產(chǎn)生線粒體活性氧,加劇細(xì)胞的損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.非轉(zhuǎn)錄依賴性途徑是指野生型p53不進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)上述基因轉(zhuǎn)錄,而是在細(xì)胞質(zhì)中直接激活Caspase途徑而啟動細(xì)胞凋亡進(jìn)程[14,15].本研究通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞內(nèi)野生型p53的表達(dá).我們觀察到,在轉(zhuǎn)染前,對比A549細(xì)胞,A549/CDDP細(xì)胞野生型p53表達(dá)明顯下調(diào),提示A549細(xì)胞對順鉑耐藥機(jī)制與野生型p53的下調(diào)有關(guān).雖然在轉(zhuǎn)染了不帶干擾序列的慢病毒后,A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞野生型p53表達(dá)均有略微上調(diào),但是在轉(zhuǎn)染了GRP75 shRNA后,A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞的野生型p53表達(dá)出現(xiàn)非常顯著地上調(diào).以上結(jié)果表明,當(dāng)GRP75的表達(dá)上調(diào)時(shí),野生型p53的表達(dá)下調(diào),而當(dāng)GRP75的表達(dá)下調(diào)時(shí),野生型p53的表達(dá)上調(diào).國外有研究[16]證實(shí),p53直接介導(dǎo)bax導(dǎo)致線粒體膜通透性改變和凋亡,而GRP75也是位于線粒體,因此我們認(rèn)為GRP75在耐藥機(jī)制中的作用與對野生型p53的調(diào)控有關(guān).GRP75通過抑制野生型p53的表達(dá),從而保護(hù)了被順鉑損傷的腫瘤細(xì)胞,避免其死亡.

bcl-2是抑制凋亡的重要因子,主要分布于線粒體膜上,調(diào)節(jié)線粒體的功能狀態(tài).bcl-2過表達(dá)可抑制c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,可以抑制依賴p53的凋亡途徑,還可以抑制非依賴p53的凋亡途徑.bcl-2不阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),不抑制藥物造成的DNA損傷,也不加速細(xì)胞的修復(fù).近年來的研究認(rèn)為bcl-2可能通過清除線粒體活性氧[17],增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力[18],來保護(hù)細(xì)胞免于死亡.本研究通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞bcl-2的表達(dá).我們觀察到,在轉(zhuǎn)染前,對比A549細(xì)胞,A549/CDDP細(xì)胞bcl-2表達(dá)明顯上調(diào),提示bcl-2可能也是A549細(xì)胞對順鉑耐藥機(jī)制的相關(guān)蛋白.當(dāng)轉(zhuǎn)染了GRP75 shRNA以后,A549/CDDP細(xì)胞的bcl-2表達(dá)明顯下調(diào).GRP75與bcl-2都是位于線粒體,兩者可能通過調(diào)節(jié)線粒體的功能狀態(tài),對受順鉑損傷的腫瘤細(xì)胞有協(xié)同保護(hù)作用.

綜上所述,我們通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾,成功地將GRP75 shRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞,有效地抑制了GRP75蛋白的表達(dá),一定程度逆轉(zhuǎn)了A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性,同時(shí)觀察到GRP75對腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響與p53和bcl-2有關(guān),但是尚不能闡明具體機(jī)理,這仍需要進(jìn)一步的深入研究.