人胚胎脊髓神經干細胞生長及分化過程中BDNF的作用研究

賀永勝，郭小兵，鄧世康，李力燕

(昆明醫學院神經科學研究所，昆明 650500)

神經管畸形所致的神經系統先天發育障礙嚴重影響了人類的健康，是全世界神經科學工作者所面臨的重要攻堅課題。在胚胎脊髓發育過程中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)發揮著重要作用，但其作用機制尚不完全清楚，且絕大多數的研究局限在實驗性的小動物，其具體對人胚胎脊髓發育時期神經干細胞的生長及分化有什么樣的影響，未見明確報道。鑒于此，本研究擬通過在對體外培養的人胚胎脊髓神經干細胞中上調或下調BDNF的水平，觀察外源性和內源性BDNF對人胚脊髓神經干細胞生長和分化的影響。希望為人類胚胎脊髓發育機制、缺陷機制及其預防和臨床治療提供直接的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料 經云南省昆華醫院和孕婦本人同意，獲取孕20周水囊引產胎兒脊髓組織標本;細胞培養板購自Costar公司，DMEM/F12購自Hyclone公司，多聚賴氨酸、胰酶、噻唑藍(MTT)購自 Sigma公司，人重組腦源性神經營養因子購自Peprotech公司，B27添加劑、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastgrowth factor，b-FGF)、表皮生長因子購自Invitrogen公司，兔抗人BDNF抗體，兔抗人神經元特異性核抗原(NeuN)抗體、兔抗人膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自 Millipore公司，兔抗人巢蛋白(Nestin)抗體購自 Santa Cruz公司，封閉用正常羊血清、PV9000試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離培養 在無菌環境下，剝離流產胎兒胸腰段脊髓組織，除去脊膜后，將組織放于適量的0.25%胰酶液中，37℃培養箱中消化5 min，拿出后輕輕吹打，以1∶1比例用DMEM基礎培養基終止，吸取細胞懸液于離心管中1000 r/min離心5 min，吸棄上清，加入含B27(1∶100)、表皮生長因子(20 μg/L)和 b-FGF(20 μg/L)的DMEM/F12培養基(B27培養基)，以5×105/mL的密度接種入六孔板中，放入37℃含5%CO2培養箱內培養，3～4 d半量換液一次。

1.2.2 神經干細胞Nestin染色鑒定 培養10 d后，離心提取細胞，加入無菌的磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入2 mL無菌的4%多聚甲醛在4℃條件下固定細胞30 min，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，含0.1%Triton的5%羊血清室溫下孵育1 h后，加兔抗人Nestin抗體(1∶200)4℃過夜，加PV-9000二抗37℃孵育30 min，DAB液顯色，顯微鏡下觀察鑒定結果。

1.2.3 神經干細胞的分組培養 在第一次半量換液時，將細胞均分為正常對照組、BDNF蛋白組、BDNF抗體封閉組，其中 BDNF蛋白組換液為含40 μg/L BDNF蛋白的B27培養基，BDNF抗體封閉組換液為含有BDNF抗體(1∶1000)的B27培養基，每組設6個獨立孔(n=6)。每天觀察各組細胞生長狀態，3 d半量換液一次。在培養第7天拍照取得結果圖片，每孔取5個視野拍攝圖片，計數每孔中各視野神經球數目并取均值。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力 各組細胞在培養第10天，1000 r/min離心提取細胞，以每孔2000個細胞的密度接種于96孔板中，每組設10個平行孔(n=10)，每孔加100 μL B27 培養基，放入37℃，5%CO2培養箱中孵育過夜，第2天換液為DMEM/F12基礎培養基，加入20 μL MTT溶液(濃度5 mg/mL)，繼續培養4 h后終止，吸棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，37℃搖床上低速振蕩10 min，酶標儀上測其OD值。

1.2.5 分化檢測 在培養第10天，離心收集細胞，接種至多聚賴氨酸包被的六孔板中，各組分別加入對應培養基，放入37℃，5%CO2培養箱內培養48 h后，倒置顯微鏡下觀察分化情況，輕輕吸棄培養基后按上述步驟進行NeuN和GFAP免疫組織化學染色檢測。每組6孔，每孔取5個視野進行拍照獲取結果并進行陽性細胞計數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件對實驗數據進行統計處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人胚胎脊髓神經干細胞的培養及鑒定 在培養第1天，細胞呈單個透亮懸浮生長，72 h后開始分裂增殖呈桑葚狀聚集，在培養第10天神經干細胞成典型神經球樣生長，神經球中心細胞由于缺乏營養而出現老化凋亡，倒置顯微鏡下觀察見透光度較差，神經球周邊部細胞增殖迅速，細胞透亮(圖1A)。經免疫組織化學Nestin染色后顯示陽性，表明所培養細胞是神經干細胞(圖1B)。

圖1 培養10 d時的人胚胎脊髓神經干細胞球及鑒定染色圖

2.2 各組神經球數目計數結果 對三組的神經球細胞數目進行比較，差異有統計學意義(F=8.470，P＜0.05)。如表1所示，與對照組比較，加入BDNF蛋白后，神經球數目沒有明顯變化(P＞0.05);而加入BDNF抗體后，神經球數目比對照組有顯著減少(P ＜0.05)。

表1 各組神經球數目計數結果

2.3 各組MTT檢測結果 三組細胞的MTT進行比較，差異有統計學意義(F=5.225，P ＜0.05)。如表2所示，BDNF蛋白組的OD值與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，而抗體封閉組的OD值與照組相比有顯著減弱(P ＜0.05)。

表2 各組MTT細胞活力檢測結果

2.4 各組神經干細胞分化情況

2.4.1 神經干細胞貼壁后分化為NeuN和GFAP陽性細胞 在培養第10天半量換液后將神經干細胞接種至多聚賴氨酸包被的培養板中，可見神經球貼壁后出現分化，其周邊開始出現長的細胞突起(圖2A)，周圍增殖的細胞開始出現一定的細胞形態(圖2B)，48 h后進行免疫組化染色，可見神經元軸突細長，胞體呈橢圓形(圖2C箭頭所示)，星形膠質細胞胞體呈多邊形，從胞體發出多個突起(圖2D箭頭所示)。

圖2 神經干細胞貼壁培養后分化為NeuN和GFAP陽性細胞

2.4.2 各組NeuN陽性細胞數比較 對三組細胞的NeuN陽性細胞進行計數后比較，差異有統計學意義(F=11.976，P ＜0.05)。BDNF 蛋白組的陽性細胞數明顯高于對照組(P＜0.05)，而BDNF抗體封閉組的NeuN陽性細胞數比對照組有顯著減少(P ＜0.05)(表3)。

表3 各組干細胞分化為NeuN陽性細胞數計數結果

2.4.3 各組GFAP陽性細胞數比較 三組細胞的GFAP陽性細胞進行計數間差異有統計學意義(F=6.266，P ＜0.05)。與對照組相比，加入 BDNF 蛋白后GFAP陽性細胞數顯著減少(P=0.019，P ＜0.05)，而經過抗體封閉后的GFAP陽性細胞數目也明顯少于對照組(P ＜0.05)(表4)。

表4 各組神經干細胞分化為GFAP陽性細胞計數結果

3 討論

神經干細胞是一類可在體內體外增殖分化的細胞，Gage［1］將神經干細胞概括為可生成神經組織或者來源于神經系統的具有自我更新能力，并且能夠通過不對稱細胞分裂產生的新細胞。神經干細胞的發現和研究改變了成年后腦神經元不可再生的傳統觀念，它在神經系統退行性變及神經系統損傷的功能恢復方面具有廣泛的應用前景。隨著研究的深入，人們發現不同種屬、同一種屬不同部位以及不同年齡(胎齡)所分離得到的神經干細胞生物學特性也有所不同［2］。目前的研究均集中在大鼠等嚙齒類動物，而由于種屬基因的差異性，人與嚙齒動物的脊髓神經干細胞之間存在很大不同，在培養條件以及對各類生長因子的反應特性也不相同。在對人胚胎期神經干細胞的研究中，已先后從大腦皮質、海馬、紋狀體、嗅球、側腦室、室管膜下層、小腦和脊髓等區域分離出神經干細胞［2］。

BDNF是神經生長因子家族的成員之一，由Barde于 1982 年從豬腦中提純獲得［3］，BDNF 由120個氨基酸組成，與神經生長因子有54%的同源性，其表達在神經系統的發育過程中具有時空特異性，能影響神經元的生長、發育、分化和成熟［4］，與神經系統的發育密切相關。BDNF可參與神經干細胞的趨化和遷移運動［5］，使得神經內分泌細胞能夠準確到達目標損傷部位并存活、增殖、分化且與宿主神經細胞建立突觸聯系。有報道提示，體外培養的胎鼠海馬神經干細胞可分泌BDNF、神經生長因子等神經營養因子［6］。已有研究也已證實嚙齒類動物種屬中BDNF可促進神經干細胞向神經元分化，且可誘導神經元突起的延伸［7，8］。那么，BDNF在人胚胎脊髓神經干細胞中的作用及其機制如何?

本課題組在實驗前期系統的研究了從第3周到第8個月的人胚胎發育脊髓中BDNF的定位及定量表達變化，發現BDNF廣泛地分布于人胚胎脊髓發育的各個時期，特別是在早期胚胎中發揮著重要的作用，而且在脊髓的中央管上皮從最初的假復層柱狀神經上皮到后期柱狀上皮的室管膜細胞，幾乎在所有的檢測時段都發現有BDNF的表達［9］，而這些部位都是神經干細胞的聚集之處。

本研究結果提示，在人胚胎脊髓神經干細胞的增殖及分化過程中BDNF發揮了重要作用，在加入外源性BDNF蛋白后，雖然神經球的數目和活力與對照組相比沒有明顯變化，但在用BDNF抗體封閉了神經干細胞內源性的BDNF蛋白后，神經球數目出現減少，細胞活力也有明顯下降。說明在神經干細胞的增殖生長過程中BDNF起著不可或缺的作用，在加入外源性BDNF蛋白未能明顯促進神經干細胞的增殖和活力，其原因可能是由于內源性BDNF的分泌已達到一個飽和的程度，或由于BDNF的功能性受體缺乏而導致剩余量的BDNF蛋白不能得到激活，以致不能引起BDNF下游目的基因的表達來促進干細胞的增殖和生長。

對于神經干細胞的研究目前還處于起步階段，隨著生命科學的不斷發展，在神經干細胞增殖分化的機制及應用等發面已經取得了初步成果，BDNF在神經分泌細胞的生長及分化過程中扮演重要角色，但仍有一些問題尚待解決:①如何應用BDNF精確控制神經分泌細胞分化為神經元的數量和方向;②如何誘導分化出的神經元向目標區域延伸并與其他神經元發生突觸聯系;③如何應用BDNF調動并誘導內源性神經干細胞的增殖和分化。這些問題的解決將對神經科學的發展有一個革命性的推動作用。

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［6］ 李玉，王波，林娜，等.體外培養神經干細胞NGF、BDNF和NT-3及其受體trkA、trkB和trkC的表達［J］.昆明醫學院學報，2011，32(2):3-6.

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