眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷72h后腦皮質BDNF表達的影響*

王 哲，高 原，馬賢德，趙金茹，井 歡，關洪全，王德山

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院，沈陽 110032)

眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷72h后腦皮質BDNF表達的影響*

王 哲，高 原，馬賢德，趙金茹，井 歡，關洪全，王德山△

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院，沈陽 110032)

目的:觀察眼針對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質腦源性神經營養因子(BDNF)表達的影響。方法:線栓法復制腦缺血再灌注損傷大鼠模型，隨機分為正常組、假手術組、模型組、眼針組。于再灌注72h后進行大鼠神經功能評分，采用RQ-PCR、免疫組化法、western blot法檢測缺血腦皮質BDNFmRNA及蛋白的表達。結果:與模型組比較，眼針組大鼠神經功能評分下降，腦皮質BDNF mRNA的表達和蛋白的表達上升(P＜0.01)。結論:眼針能提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質BDNF表達水平。

缺血再灌注;腦源性神經營養因子;眼針;腦皮質

隨著溶栓及介入治療的開展，腦梗死患者部分腦組織重新獲得血液，減輕了腦組織損傷，但與此同時也大大增加了腦缺血再灌注損傷的危險。腦缺血損傷后腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達增高，一定程度上可延緩缺血后神經元損傷。大量實驗證實［1］，BDNF對腦缺血再灌注具有保護作用，并能促進缺血后損傷神經元的存活、修復和再生。眼針療法是彭靜山教授根據中醫學基本理論結合長期的臨床實踐所創立的一種微針療法。眼針對于急、慢性腦血管疾病等具有顯著的療效，但是其作用機制至今尚不清楚。本研究采用改良的線拴法制備大鼠腦缺血再灌注損傷的動物模型，以刺針眼穴肝區、上焦區、下焦區、腎區各穴后，觀察眼針對大鼠腦皮質BDNF表達的影響，旨在探討眼針對缺血后神經元損傷的保護機制，為臨床眼針治療缺血性腦血管疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康SPF級 SD大鼠64只，雌雄不拘，體質量280g±20g，由北京維通利華實驗動物中心提供(許可證號SCXK(京)2007-0001)。適應性喂養1周，自由飲水，攝取標準顆粒飼料，室內溫度22℃，相對濕度45%。按隨機數字法將大鼠分為對照組、假手術組、模型組、眼針組4組，每組16只。

1.2 模型制備與評價

模型組及眼針組采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，模型制作參照文獻［2］。模型成功標準:大鼠于缺血2h后進行再灌注，再灌注后進行神經功能缺損評分，參照ZeaLonga 5分制評分標準:0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側前爪;2分為向對側轉圈;3分為向對側傾倒;4分為不能自發行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。假手術組術式同模型、眼針組，區別在于釣魚線插入深度為0.5cm～1cm，其他同手術組。正常組未處理。

1.3 眼針取穴及刺法

眼針組:采用13mm毫針，于大鼠眶周2mm處針刺，定位參照人體取穴方法［3］，取肝區、上焦區、下焦區、腎區針刺見圖1。針刺手法:從眼眶邊緣1mm部位平刺，左眼按照順時針方向(右側按逆時針方向)，從該穴區起始定位線向終止定位線進針，進行平刺操作，刺入真皮達到皮下組織，進針3mm到終止定位線為止。留針20min，留針10min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時機:眼針組于腦缺血再灌注即刻及取材前30min(再灌注后2.5h)分別進行眼針治療，中間每間隔12h針刺1次，共7次。正常組、假手術組和模型組無其他處理。大鼠眼針取穴具體部位見圖1。

圖1 大鼠眼針取穴示意圖

1.4 試劑及實驗用藥

實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物，BDNF引物由北京華大基因公司合成，親和純化兔抗鼠BDNF多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 指標測定

1.5.1 腦皮質 BDNF蛋白表達(免疫組化SABC法) 于缺血再灌注損傷72h對大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，將灌注針頭從心尖部插入升主動脈，待右心耳膨起后剪開右心耳，依次迅速灌注0.9%生理鹽水200ml，4%多聚甲醛200ml，迅速取腦，在視交叉平面后約5mm～10mm處將腦冠狀切面切開，留取中間部分，置于4%多聚甲醛固定液中固定，常規脫水、石蠟包埋。將包埋的蠟塊做5μm切片，免疫組化按試劑盒說明書操作。BDNF以細胞膜或細胞漿出現清晰棕褐色顆粒為陽性。根據大鼠腦缺血半暗帶的定位方法［4］，使用BI2000醫學圖像分析系統對采集的圖像測定陽性反應物的灰度，每例動物隨機取3～4張切片，且各組所選部位相同(額頂葉皮質)。

1.5.2 腦皮質BDNF蛋白表達(Western blot法) 于缺血再灌注損傷72h對各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，每組8只去掉小腦，沿兩側大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側梗死灶周圍皮質分成兩部分，一部分做蛋白表達(另一部分做PCR)，按腦組織凈重:裂解液=1∶10的比例，加入相應體積的裂解液，PH值為7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心、上清即為總蛋白。兔抗鼠 BDNF一抗(1∶500);O-dianidine，βnaphthyl acid phosphate顯色，掃描儀掃描 NC膜，分析結果。

1.5.3 腦皮質BDNF mRNA的表達 采用RQ-PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTACA CGAAGGA 3';BDNF下游引物:5'GCCCGAA CATACGATT3'。β-actin為內參，其上下游引物分別為:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGC CGATA GTGA TGACCT 3'。所有的產物在 ABI Prism 7500 HT序列檢測系統中運行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內參，以擴增倍數作為比較的依據:△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗－△CT對照，擴增倍數=2－△△CT。將所擴增的PCR產物同時進行溶解曲線分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 神經功能缺損評分

模型組和眼針組大鼠均出現不同程度的神經功能障礙，如提尾時左側前肢不能伸直，行走向對側旋轉或傾倒等，而假手術組大鼠無神經功能障礙表現。模型組再灌注損傷72h后神經功能缺失癥狀明顯加重，與造模后即刻神經功能缺損評分無差異。眼針組再灌注損傷72h后與造模后即刻神經功能缺損評分有差異(P＜0.01)。

表1 各組神經缺損評分比較(±s，n=8)

表1 各組神經缺損評分比較(±s，n=8)

注:與造模后即刻比較:△P＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01

組別 造模后即刻評分 72h 評分正常組00假 手 術 組 0 0模 型 組 2.63±0.92 2.63±0.74眼 針 組 2.63±0.92 1.63±0.52△＊＊

2.2 各組BDNF蛋白表達的比較

免疫組化方法檢測結果顯示，正常組和假手術組大鼠右側額頂葉腦組織均有多量BDNF陽性表達，免疫陽性顆粒主要位于神經元細胞核和細胞質，以胞漿邊緣顯色較深。表2、圖2顯示，與正常組和假手術組比較，模型組BDNF的陽性表達顯著降低，有顯著性差異(P＜0.01)。與模型組比較，眼針組BDNF表達明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)。

圖2 眼針對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質BDNF蛋白表達的影響(SABC法 ×400)

Western blot方法檢測結果顯示，取大鼠右側梗死區半暗帶腦皮質檢測 BDNF蛋白表達，以β-actin為內參，模型組BDNF蛋白表達下降，與正常組和假手術組比較有顯著性差異(P＜0.01)，眼針組BDNF蛋白表達明顯強于模型組(P＜0.01)見表2、圖3。

表2 各組BDNF蛋白表達的比較(±s，n=8)

表2 各組BDNF蛋白表達的比較(±s，n=8)

注:與模型組比較:＊＊P ＜0.01

組 別 免疫組化BDNF灰度值 Western BDNF 灰度值正 常 組 161.3377±11.8654＊＊ 0.7124±0.0234＊＊假 手 術 組 155.0047±14.3928＊＊ 0.7118±0.0673＊＊模 型 組 122.8066±10.5518 0.3327±0.0343眼 針 組 144.0593±13.2793＊＊ 0.6964±0.0388＊＊

圖3 各組BDNF蛋白表達影響

2.3 各組BDNF mRNA表達的比較

實時定量PCR方法檢測結果顯示，采用實時定量PCR方法檢測腦梗死區BDNF mRNA表達的結果如表3所示，本實驗選用β-actin作為內參，BDNF基因擴增產物大小為237bp，β-actin基因擴增產物為132bp。模型組 BDNF mRNA表達明顯降低，與正常組和假手術組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，眼針組BDNF mRNA表達升高，與模型組比較有顯著差異(P＜0.01)。

表3 各組BDNFmRNA表達的比較(±s，n=8)

表3 各組BDNFmRNA表達的比較(±s，n=8)

注:與模型組比較:＊＊P ＜0.01

組 別 BDNF 相對含量正 常 組 1.03±0.18＊＊假手術組 1.1 ±0.12＊＊模 型 組 0.36±0.05眼 針 組 0.8±0.19＊＊

3 討論

BDNF由Barde［5］等在1982年從豬腦中首先分離和純化，屬于神經生長因子家族成員，在維持神經元功能及其損傷后再生修復方面發揮著重要作用。體外及體內實驗研究均證實，BDNF在神經元存活、神經發生分化和增殖以及學習、記憶等方面扮演著重要的角色［6］。BDNF由神經細胞合成并廣泛分布于中樞神經系統，以大腦皮質、海馬、紋狀體分布最為豐富。本實驗結果表明，大鼠腦缺血再灌注后，腦組織受損，機體出現神經功能缺損的癥狀。正常組大鼠腦皮質有較多量的 BDNF表達，因為 BDNF是惟一不斷在中樞神經系統和周圍神經組織中表達的神經營養因子。模型組大鼠腦皮質BDNF的表達下調，說明缺血再灌注進一步加重腦組織的損傷。眼針組大鼠腦皮質中BDNF的表達明顯上調，促進神經元缺血再灌注損傷后的修復，使大鼠神經功能缺損癥狀得到一定的緩解。BDNF表達的增加可能通過拮抗興奮性氨基酸毒性［7］，穩定細胞內 Ca2+濃度;增強 GSH-Px 及 SOD 的表達［8、9］，減少自由基的生成;調節 Bcl、Bax 蛋白的表達［10］，拮抗 caspase 活性［11］等途徑參與腦缺血損傷后神經元的保護。

目前，臨床上對于腦缺血再灌注損傷疾病的治療效果并不十分理想，亟待尋求新的治療途徑和方法。眼針療法是由遼寧中醫藥大學附屬醫院著名老中醫彭靜山教授于20世紀70年代首創，即在眼眶周圍針刺以治療全身疾病的一種微針技術，它是針灸施術的一種特殊針法。根據王肯堂轉載華元化云:“……皆懸貫于腦，下連臟腑，通暢血氣往來以滋于目”的記載，我們提出“眼絡于腦，通調臟腑”的中醫理論新假說。缺血性中風病機總屬陰陽失調、氣血逆亂，病位在心腦，與肝腎密切相關。眼針通過刺激眶周穴區達到疏通經絡、行氣活血、調整臟腑陰陽的作用。治療以三焦取穴為主，取上、下焦區以疏通上下肢經絡，暢通氣血，從而促進肢體功能恢復;配合循經取穴，取肝、腎區平調臟腑陰陽以治本，標本兼顧，故能取得良效。本實驗結果顯示，通過刺針眼穴肝區、上焦區、下焦區、腎區治療后可以有效地利用并促進內源性BDNF的表達，通過直接增加缺血性腦損傷大鼠海馬組織BDNF蛋白的表達，來實現對腦細胞損傷的保護作用。

［1］Blanquet PR，Mariani J，Fournier B．Identification of a biphasic signaling pathway involved in ischemic resistance of the hippocampal dentate gyrus［J］．Exp Neurol，2006，202(2):357-372．

［2］馬賢德，孫宏偉，等．線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究［J］．中華中醫藥學刊，2009，27(6):1200-1201．

［3］彭靜山．眼針療法［M］．沈陽:遼寧科學技術出版社，1990:11．

［4］Love S．Oxidative stress in brain ischemia［J］．Brain Pathol，1999，9(1):119-125．

［5］Barde Y A， EdgarD， Thoenen H． Purification ofanew neurotrophic factor from mammalian brain［J］．J EMBO，1982，(1):549-553．

［6］Marini A M，J iang X，Wu X，et al．Preconditioning and neurotophins:a model for brain adaptation to seizures，ischemia and other stressful stimuli［J］．Amino Acids，2007，32:299-304．

［7］Brandoli C．，Sanna A ，De Bernardi MA ，et al．Brain-derived neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor downregulate NMDA receptor function in cerebellar granule cells［J］．Neurosci，1998，18(19):7953-7961．

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The Effect of Eye Acupuncture on Brain-deprived Neurotrophic Factor Expression in Rat cerebral cortex with Ischemia-reperfusion injury for 72 hours

WANG Zhe，GAO Yuan，MA Xian-de，ZHAO Jin-ru，JING Huan，GUAN Hong-quan，WANG De-shan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110032，China)

Objective:To investigate the effects of eye acupuncture on brain-deprived neurotrophic factor(BDNF)expression and study the mechnism of ischemia-reperfusion injury improved．Methods:Rats established by suture method were randomly divided into the control group，the sham operation group，the model group and the eye-acupuncture group．After reperfusion 72h，the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks;the expression of ischemic cerebral cortex BDNF mRNA was measured by RT-PCR method;the expression of ischemic cerebral cortex BDNF protein was detected by immunohisto-chemistry and Western blot technology．Results:After reperfusion 72h，compared with the model group，the neurologic impairment marks of the eye-acupuncture group decreased obviously(P＜0．05);The expressions of BDNF mRNA and protein in rat cerebral cortex after the eye acupuncture therapy were obviously decreased(P＜0.01)．Conclusion:The eye acupuncture therapy can increase the expression of BDNF in rat cerebral cortex with ischemia-reperfusion injury，and protect brain by improving the repair of neurons．

ischemia-reperfusion injury;Eye acupuncture;brain-deprived neurotrophic factor;cerebral cortex

R245．32+9

B

1006-3250(2011)09-1007-03

國家重點基礎研究發展計劃資助項目(2007CB512702);遼寧省教育廳科學技術研究項目(L2010351)

2011-03-08

王 哲(1971-)，女，遼寧海城人，教授，醫學博士，從事中醫肺脾腎對水液代謝調控機制研究。

△通訊作者:王德山，男，教授，從事中醫學肺、脾、腎功能調控機體水液代謝的機制研究，E-mail:wwddss5768@sohu．com。