電針對抑郁模型大鼠海馬腦源性神經營養因子基因表達的影響

韓焱晶，李文迅，賈寶輝，時宇靜，圖 婭△

(1.中國中醫科學院針灸研究所，北京 100700;2.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029;3.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053;4.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

腦源性神經營養因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)是神經營養素家族中的主要成員之一，對神經元突觸可塑性和神經網絡的構建產生重要影響，在抑郁癥的發病機制中起著重要作用。本研究通過觀察電針對抑郁模型大鼠不同時段行為的影響，明確針刺治療抑郁癥的作用時效，并在此基礎上進一步探討電針對模型大鼠海馬BDNF mRNA表達的影響，旨在明確電針治療抑郁癥的部分機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SD健康雄性大鼠，清潔級，體質量173.97g±13.03g，購于北京維通利華實驗動物技術有限責任公司(動物使用許可證號 SCKX(京)2004-0001)。除實驗期間的特殊要求外，動物飼養于溫度18℃ ～25℃、濕度552%的環境中，自然光照。

1.2 儀器及試劑

自制敞箱(80cm×80cm×40cm)，韓氏 LH 202型電針儀(北京華衛產業開發公司提供)，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(同濟醫科大學清平影像工程公司研制)，Olympus光學顯微鏡(日本)。BDNF檢測探針提供者是北京奧科生物技術有限責任公司，BDNF原位雜交試劑盒由武漢博士德試劑公司提供。

1.3 動物分組

動物購回后適應性喂養1周，自由進食水。然后通過開野實驗將水平運動次數加垂直運動次數不足30次或超過120次的大鼠剔除，再按體重隨機分為正常組、模型組和電針組，每組10只，正常組每籠飼養5只，其余組單籠飼養。

1.4 造模方法

適應性喂養結束后，根據文獻［1］方法改進，用慢性應激結合孤養的方式造模。給予模型組和電針組21d各種不同的刺激，包括冷水游泳(10℃，5min)、夾尾(3min)、禁水(24h)、禁食(24h)、電擊足底(電壓為30V，電擊5s，間歇 5s，共進行 2min)、晝夜顛倒(24h)、溫箱(40℃ 5min)，每天隨機安排1種刺激方式，每種刺激在實驗全程中使用3次。正常組大鼠不給予任何刺激。

1.5 電針方法

電針組于造模的第1天起，于每日上午應激刺激前1h進行電針。參照《實驗針灸學》［2］取“百會”、“印堂”穴，用華佗牌30號13mm長的毫針進行針刺，均平刺0.5cm左右，針柄接韓氏電針治療儀，頻率2Hz，電流強度0.6mA左右，以大鼠頭部微顫為宜。留針20min，每日1次，連續針刺21d。

1.6 行為學檢測

于實驗前 1d、實驗第 7、14、21天測量大鼠體重，并進行開野實驗及糖水消耗實驗。

開野實驗測定方法:本實驗所用敞箱為立方體，周壁、底面為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25塊。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內，以動物穿越底面的格數(四爪均進入方格方可記數)為水平運動次數，以后肢直立次數(兩前爪騰空或攀附箱壁)為垂直運動次數。每只動物測定1次水平運動次數及垂直運動次數，每次測定時間為3min，徹底清潔敞箱后再進行下1只大鼠的觀察。

糖水消耗實驗方法:于開野實驗后將大鼠禁水24h，然后給予 1%(w/v)的蔗糖水溶液，加瓶重250g，同時禁食，24h后稱量蔗糖水瓶的重量，計算大鼠在24h內蔗糖水消耗量。因不同體重的大鼠對蔗糖水的需求量各異，故統計時采用求實際糖水消耗與大鼠體重比值的方法(相對糖水消耗量)，以每千克動物體重消耗糖水重量(g/kg)計算。

1.7 原位雜交法檢測海馬BDNF mRNA表達

實驗結束后的第1天每組隨機抽取5只大鼠進行取材。用10%水合氯醛(0.5mL/100g)麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經左心快速灌流生理鹽水100mL左右，隨即灌注含4%多聚甲醛、30%苦味酸和0.1mol/L的 PBS混合液150mL，持續30min。灌畢取全腦，浸入4%多聚甲醛內，4℃冰箱保存24h;取含海馬腦段的組織，用0.1mol/L PBS浸洗后，脫水透明，石蠟包埋，切片機上做連續冠狀切片(5μm)用于原位雜交檢測。

(1)切片預處理:切片常規脫蠟至水;0.2mol/L HCl處理 20min，然后用 0.1%DEPC、0.01mol/L PBS、0.2%甘氨酸各洗 2次，每次 3min;蛋白酶 K 1μg/mL，37℃ 消化 15min ～20min，0.2% 甘氨酸、0.01mol/L PBS、0.1%DEPC各洗 2次，每次 3min;逐級乙醇脫水，每次5min;(2)預雜交:滴預雜交液20～30mL/片，42℃孵育 30min ～2h;(3)雜交:將探針DNA和雜交液混合后，煮沸變性10min，迅速置冰上冷卻，然后每張切片滴加10μL～20μL變性雜交液，蓋上清潔硅化蓋玻片，用石蠟油將蓋玻片四周封閉，將切片放入烤箱中加熱85℃10min，迅速取出在冰上冷卻3min，放入2×SSC濕盒內，42℃溫箱孵育24h～36h，使其雜交;(4)洗滌:浸入無水乙醇2次，每次5min，清洗蓋玻片;2×SSC，0.1%SDS振搖清洗2次，每次 3min;0.1×SSC，0.1%SDS振搖清洗2次，每次3min;(5)封閉:緩沖液Ⅰ洗3次，每次3min;緩沖液Ⅱ封閉 30min，37℃;(6)信號檢測:地高辛-AP復合物 1∶5000，37℃ 1h;緩沖液Ⅰ清洗 3次，每次3min;緩沖液Ⅲ清洗3次，每次3min;顯色過夜;TE緩沖液終止顯色;脫水，甘油明膠封片。置光學顯微鏡下觀察并照相。每只動物取相同部位的切片2張，選擇海馬CA3區為測定部位，光鏡40×10倍條件下連續選取3個視野，用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統對其原位雜交陽性信號的表達面積及平均灰度進行測定。

1.8 統計方法

2 結果

2.1 電針對大鼠開野實驗的影響

表1顯示，應激前各組活動度水平相同(P＞0.05)。與本組實驗前及正常組比較，應激刺激 7d后模型組水平運動及垂直運動均明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)。而電針組接受應激刺激7d以后的水平運動次數、垂直運動次數均高于模型組(P＜0.05～0.001)，說明慢性應激結合孤養可引發大鼠的抑郁癥狀，電針可以防治抑郁的發生。

表1 各組大鼠開野實驗行為學比較(±s)

表1 各組大鼠開野實驗行為學比較(±s)

項 目 組 別 鼠數 實驗前 第7天 第14天 第21天水平運動 正常組 10 71.3±4.7 50.1±6.4* 50.2±8.5* 48.3±9.9＊＊模型組 10 66.8±4.6 29.2±6.3△ 24.7±7.0△ 15.2±3.3△電針組 10 72.2±7.2 55.3±6.5＊＊ 53.2±9.3* 56.1±8.0＊＊＊垂直運動 正常組 10 13.6±1.7 10.2±1.3* 8.7±1.3* 10.6±2.4*模型組 10 9.2±1.7 4.7±1.2△ 3.8±1.4△ 2.4±0.6△電針組 10 13.4±2.2 11.1±2.4* 8.2±1.8* 10.7±2.7*

注:與本組實驗前比較:△P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

2.2 電針對糖水消耗實驗的影響

表2顯示，實驗前各組大鼠的糖水消耗量相比差異無統計學意義(P＞0.05)。造模第21天時，模型組與正常組比較糖水相對消耗量顯著降低(P＜0.05)，電針組與模型組比較糖水相對消耗量顯著升高(P＜0.05)，模型組、電針組與本組實驗前比較糖水相對消耗量均顯著降低(P＜0.05)。

2.3 電針對海馬區BDNF mRNA表達的影響

圖1顯示，正常組大鼠海馬CA3區可見較多的BDNF mRNA雜交陽性信號，位于胞質中，呈紫藍色;模型組大鼠海馬CA3區的BDNF mRNA雜交陽性信號明顯減少;電針組的BDNF mRNA雜交陽性信號介于兩者之間。表3顯示，陽性信號的細胞面積模型組顯著低于正常組(P＜0.01)，電針組明顯高于模型組(P＜0.05);平均灰度值模型組顯著高于正常組(P＜0.01)，電針組明顯低于模型組(P＜0.05)。灰度值的大小與陽性信號的多少成反比。因此統計結果表明，抑郁模型大鼠海馬區 BDNF mRNA的表達明顯減少，電針可促進海馬區 BDNF mRNA的表達。

表2 各組大鼠糖水相對消耗量的比較(±s，g/kg)

表2 各組大鼠糖水相對消耗量的比較(±s，g/kg)

注:與本組實驗前比較:△P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05

組 別 鼠數 實驗前 第7天 第14天 第21天正常組 10 267.47±21.79 327.20±27.15 275.58±18.20 252.64± 9.93*模型組 10 308.32±11.98 280.80±14.18 274.90±14.20 203.09±14.54△電針組 10 316.68±19.44 281.10±15.77 267.40±13.50△ 262.88±23.70△＊

圖1 各組大鼠海馬CA3區BDNF mRNA表達光鏡觀察(原位雜交法×400，箭頭所指為陽性細胞)

表3 各組大鼠海馬CA3區BDNF mRNA表達變化的比較(±s)

表3 各組大鼠海馬CA3區BDNF mRNA表達變化的比較(±s)

注:與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 鼠數 陽性細胞面積(μm2)陽性細胞灰度值正常組 5 444.60±32.76＊＊ 76.29± 8.78＊＊模型組 5 170.74±20.14 112.77±29.03電針組 5 268.76±33.58* 83.94±10.43*

3 討論

BDNF對周圍和中樞神經元均有廣泛的作用［3］。很多研究資料表明，BDNF與中樞神經系統神經元的生存以及多巴胺能、膽堿酯能、5-羥色胺能神經元的可塑性密切相關;BDNF與酪氨酸激酶B結合后可啟動細胞內信號傳導途徑，從而產生相應分子，對神經元起保護、促進再生作用;BDNF也可以經胞體順行運輸至軸突末端并釋放，被次級神經元攝取和利用，參與突觸可塑性。

最近的研究證實，神經營養因子與神經元的可塑性和存活有關，可能涉及抑郁癥的發病和治療機制。BDNF是5-羥色胺能神經元的生長因子，大鼠中腦慢性注射BDNF可增加5-羥色胺更新率和去甲腎上腺素水平;在成年大鼠大腦皮層注射BDNF甚至可以產生新的茂盛的 5-羥色胺神經末梢［4］。BDNF對5-羥色胺神經元生長和再生的作用提示了神經營養因子與抑郁癥之間的關系。BDNF表達下調可能參與慢性應激抑郁癥時海馬結構和功能的改變。心理以及物理應激能下調海馬BDNF mRNA表達，提示與應激相關的抑郁癥與海馬BDNF有密切聯系［5］。臨床資料顯示，抑郁癥患者血清 BDNF水平下降［6］;尸解研究發現，經抗抑郁藥治療的抑郁癥患者，海馬區 BDNF水平明顯增加［7］。這些動物和臨床實驗的結果支持了BDNF在抑郁癥病理機制中的作用，也說明腦內BDNF上調具有抗抑郁效應。

本課題組前期探討了電針對慢性應激抑郁模型大鼠腦中BDNF相關轉錄因子表達的影響，本實驗在前期工作基礎上觀察抑郁模型大鼠行為學的改變，同時應用原位雜交技術定量檢測了電針對其海馬BDNF mRNA表達的影響。根據呂梅等［8］對近10余年來針灸治療抑郁癥穴位使用頻次情況的統計，本實驗選用了其中效果最好、使用率最高的2個主穴，即百會和印堂。結果表明，電針“百會”、“印堂”可改善大鼠的抑郁癥狀，并可對抗應激引起的海馬CA3區BDNF mRNA的減少，增加其表達量。說明電針對海馬區BDNF mRNA的影響以及對海馬神經元的保護作用是電針治療抑郁癥的機制之一，可能是電針刺激 BDNF mRNA的表達，延長海馬CA3區神經元的軸突和增加神經元細胞樹突分支的密度，起到了提高神經元重建的作用;神經元活性增強促進神經營養素的合成、釋放和轉移，BDNF的釋放反過來又激活細胞內信號途徑，增強突觸效應的傳遞，從而能夠提高動物情緒，改善抑郁的病理發展。

本文行為學觀察所見模型大鼠糖水消耗量降低是由于造模應激刺激所致的抑郁癥狀引起還是造模導致的胃腸功能紊亂等因素的影響，有待在今后的研究中設立飲用純水組進行比較，以便得出更加科學的結論。

［1］Murua VS，Gomez RA，Andrea ME，et al.Shuttle-box deficits induced bychronicvariablestress:reversalbyimipramine administration［J］.Pharmacol Biochem Behav，1991，38(1):125-130.

［2］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2003:327-329.

［3］秦桂霞.BDNF對大鼠腦神經細胞損傷的保護作用［J］.黑龍江醫藥，2006，19(1):51-52.

［4］Altar CA.Neurotrophins and depression［J］.Trends Pharmacol Sci，1999，20(2):59-61.

［5］Rasmusson AM，Shi L，Duman R.Downregulation of BDNF mRNA in the hippocampal dentate gyrus after re-exposure to cues previously associated with footshock［J］. Neurop-sychophar macology，2002，27(2):133-142.

［6］Monteleone P，Serritella C，Martiadis V，et al.Decreased levels of serum brain-derived neurotrophic factor in both depressed and euthymic patients with unipolar depression and in euthymic patients with bipolarⅠ and Ⅱ disorders［J］.Bipolar Disord，2008，10(1):95-100.

［7］Chen B，Dowlatshahi D，MacQueen GM，et al.Increased hippocampal BDNF immunoreactivity in subjects treated with antidepressant medication［J］.Biol Psychiatry，2001，50(4):260-265.

［8］呂 梅，王玲玲.針刺治療抑郁癥選穴頻次的分析［J］.針灸臨床雜志，2003，19(8):15-16.