天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射損傷的保護(hù)功能研究

劉雅萍，陳曉霞，劉漢石

(大連普瑞康生物技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116001)

天山雪蓮Saussurea involucrateKar.Et Kir.系菊科風(fēng)毛菊屬植物，主產(chǎn)于新疆天山、昆侖山，是具有重要藥用價(jià)值的名貴中草藥。由于天山雪蓮生長環(huán)境特異，人工栽培困難，加之過度采挖，目前該物種瀕臨滅絕［1、2］。為解決珍稀瀕危藥用植物的資源問題，本公司利用從中國科學(xué)院植物研究所轉(zhuǎn)化的天山雪蓮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)多年研究實(shí)現(xiàn)了天山雪蓮細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)，生產(chǎn)出有效成分含量高、產(chǎn)量大的天山雪蓮培養(yǎng)物。

天山雪蓮素有“雪山花王”之稱，生長在低溫、風(fēng)大、紫外輻射強(qiáng)的高原雪線以上地區(qū)，具有活血通經(jīng)、散寒除濕、強(qiáng)筋助陽等功效［3］。有研究表明，雪蓮花水提取物對輻射損傷有保護(hù)作用［4］，但對天山雪蓮培養(yǎng)物輻射保護(hù)能力評估的研究極少。本研究通過輻射損傷小鼠模型來探討天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 樣品

普瑞康牌雪神膠囊由大連普瑞康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(批號20050501)，其每粒配方為天山雪蓮培養(yǎng)物12mg，淀粉288mg，每次4粒，每天2次。

1.2 動(dòng)物

昆明種清潔級雌性小鼠192只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場提供(許可證號SCXK-京 2004-0001)，體重 20g±2g。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 E400生物顯微鏡(2005011);755紫外光柵分光光度計(jì)(2002001)，MEK-6318K血液分析儀(2004012)。

1.3.2 試劑 Hank’s液、Giemsa染液、小牛血清、1/15mol·L－1磷酸鹽緩沖液(pH6.8)及 SOD 試劑盒(批號20051010)。

1.4 方法［5］

1.4.1 劑量 實(shí)驗(yàn)設(shè)人體推薦劑量的5倍、10倍、30 倍，即每日 0.2g/kg BW、0.4g/kg BW、1.2g/kg BW(相當(dāng)于每日 8mg/kg BW、16mg/kg BW、48mg/kg BW天山雪蓮培養(yǎng)物)，為低、中、高劑量組。受試物用無菌水配制，每日1次，經(jīng)口給予，連續(xù)灌胃30 d后輻照動(dòng)物，輻照后仍然給予受試樣品。小鼠灌胃體積為0.1mL/10g鼠量。同時(shí)設(shè)一輻射模型對照組，用無菌水代替受試物，每日灌胃體積與各受試物組相同。

1.4.2 對小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 受試樣品組小鼠于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量60Co-γ射線全身照射1次，照射劑量選擇3Gy。分別于照射前、照射后第3天、照射后第 14天 3次取血 20μL，用 MEK-6318K血液分析儀進(jìn)行白細(xì)胞數(shù)測定。

1.4.3 對小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響 受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均同一劑量γ射線全身照射1次，照射劑量選擇3Gy。于照射后第3天頸椎脫臼殺死動(dòng)物，取股骨用止血鉗擠出骨髓液與玻璃片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片。涂片自然干燥后，放入甲醇中固定 10min，放入 Giemsa應(yīng)用染液中，染色25min，立即用磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、晾干。鏡檢每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中微核細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。

1.4.4 對小鼠血中超氧化物歧化酶活性的影響 (1)受試樣品組照射前后經(jīng)口給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一計(jì)量γ射線全身照射1次，照射劑量選擇7 Gy。于照射后7 d進(jìn)行試驗(yàn);(2)紅細(xì)胞抽提液制備，10 μL全血沖入0.5 mL生理鹽水，2000 r·min－1離心 3 min棄上清，速混合器抽提 1 min，4000 r·min－1離心 3 min分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，上清液體積為0.26 mL，待測;(3)SOD活力測定，參照試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.4.5 血清溶血素(半數(shù)溶血值)實(shí)驗(yàn) 受試樣品組照射前后經(jīng)口給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射1次，照射劑量選擇1 Gy。于照射后第11天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每只小鼠腹腔注射0.2 mL綿羊紅細(xì)胞(SRBC)(2%v/v)進(jìn)行免疫。4 d后摘除眼球取血，放置1 h后將凝固的血與SA緩沖液稀釋(200倍)。取稀釋后血清 1.0 mL，SRBC(10%v/v)0.5 mL，補(bǔ)體 1.0 mL 加入同一離心管中。另設(shè)不加血清的對照管(以 SA液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫15 min后，冰水浴終止反應(yīng)。2000 r·min－1離心10 min。取上清液1.0 mL、都氏試劑 3.0 mL于試管內(nèi)，同時(shí)取SRBC(10%v/v)0.25 mL 加都氏試劑到 4.0 mL 作為半數(shù)溶血管。各試管充分混勻，放置10 min后于540 nm處以對照管作為空白，分別測定各管光密度值。半數(shù)溶血值按下式計(jì)算:

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 ＜F0.05。結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F值≥F0.05P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

表2顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠輻射后第3天外周血白細(xì)胞數(shù)與輻照前比較顯著降低(P＜0.01)，說明造摸成功。輻射后第3天，48mg/kg BW組與0 g/kg BW組比較，外周血白細(xì)胞數(shù)有極顯著差異(P＜0.01);輻射后第 14天，48mg/kg BW 組與 0 g/kg BW組比較，外周血白細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)。其他各給藥組動(dòng)物外周血白細(xì)胞數(shù)也有一定的提高，但無顯著性差異，提示天山雪蓮培養(yǎng)物可有效提高輻射損傷模型小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)。

表2天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響(±s)

表2天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響(±s)

注:與0 g/kg BW 組比較:*P≤0.05，＊＊ P≤0.01與輻射前自身比較:△ P≤0.05，△△P≤0.01

組別及劑量 例數(shù) 輻射前(×109·L－1)輻射后第3d(×109·L －1)輻射后第14 d(×109·L －1)3.6 ± 0.8 8mg/kg BW 12 6.7 ±1.0 1.9 ± 0.4△△ 4.2 ±0.9 16mg/kg BW 12 6.9 ±1.1 2.1 ± 0.5△△ 4.4 ±0.7 48mg/kg BW 12 6.8 ±1.1 2.4 ± 0.6＊＊△△ 4.7 ±0.9 0mg/kg BW 12 6.6 ±1.5 1.7 ± 0.5△△*

2.2 天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

表3顯示，輻照后第3天，48mg/kg BW 組與0 g/kg BW組比較，骨髓細(xì)胞微核率有顯著性差異(P＜0.05)，其他各給藥組無顯著降低，提示天山雪蓮培養(yǎng)物可降低輻射損傷模型小鼠骨髓細(xì)胞微核率。

表3天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響(±s)

表3天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響(±s)

注:與 0 g/kg BW 組比較:*P≤0.05，＊＊ P≤0.01

組別及劑量 例數(shù) 微核數(shù)(個(gè)) 骨髓細(xì)胞微核率(‰)0 mg/kg BW 12 194 16.2 8mg/kg BW 12 190 15.8 16mg/kg BW 12 169 14.1 48 mg/kg BW 12 155 12.9*

2.3 天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影響

表4顯示，輻照后第7天，48mg/kg BW 組與0 g/kg BW組比較，小鼠血中超氧化物歧化酶活性有顯著差異(P＜0.05)，即天山雪蓮培養(yǎng)物在48mg/kg BW組可提高輻射損傷模型小鼠血中超氧化物歧化酶活性。

表4 天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影響(±s)

表4 天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影響(±s)

注:與 0 g/kg BW 組比較:*P≤0.05，＊＊ P≤0.01

組別及劑量 例數(shù) 血中SOD活性(U·g－1Hb)0 mg/kg BW 12 8354±2320 8mg/kg BW 12 10024±2369 16mg/kg BW 12 10238±2118 48 mg/kg BW 12 10923±2065*

2.4 天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠血清溶血素的影響

表5顯示，輻照后第11天，各劑量組輻射后小鼠血清溶血素與0 g/kg BW組相比較，差異均無顯著性(P＞0.05)，即天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射損傷模型小鼠血清溶血素?zé)o影響。

表5天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠血清溶血素的影響(±s)

表5天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射后小鼠血清溶血素的影響(±s)

組別與劑量 例數(shù) 半數(shù)溶血值0 mg/kg BW 12 94.5 ±21.8 8mg/kg BW 12 101.3 ±27.2 16mg/kg BW 12 112.0 ±25.6 48 mg/kg BW 12 117.8 ±26.3

3 討論

輻射對機(jī)體的損傷主要表現(xiàn)在對血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的損害和誘導(dǎo)細(xì)胞癌變等方面［6］，特別是造血系統(tǒng)，它對輻射高度敏感［4］。然而，對于植物雪蓮對輻射損傷保護(hù)作用的研究多集中在免疫系統(tǒng)方面［6-8］。本研究從血液系統(tǒng)、染色體及氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)3個(gè)方面，分別考察了天山雪蓮培養(yǎng)物對輻射損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48mg/kg BW組能提高輻射后第3天輻射損傷模型小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)(P＜0.01)，提高輻照后第14天輻射損傷模型小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)，降低輻射損傷模型小鼠骨髓細(xì)胞微核率(P＜0.05)，提高輻射損傷模型小鼠血中超氧化物歧化酶活性(P＜0.05)，且對小鼠體重增長無不良影響。

天山雪蓮培養(yǎng)物是選取優(yōu)質(zhì)野生天山雪蓮細(xì)胞，經(jīng)多年優(yōu)選細(xì)胞繼代培養(yǎng)而成，具有主要有效成分含量高、生長周期短等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，苞葉雪蓮水提物用量在0.75 g/kg BW時(shí)能量提高輻射損傷小鼠的白細(xì)胞數(shù)［10］，而天山雪蓮培養(yǎng)物做為普瑞康牌雪神膠囊的主要成分，在48mg/kg BW劑量時(shí)具有明顯的抗輻射損傷作用，其作用可能是源于天山雪蓮培養(yǎng)物中的總黃酮和多糖等成分具有強(qiáng)大的抗氧化、抗自由基作用［9］，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

天山雪蓮培養(yǎng)物具有明顯的抵抗輻射損傷引起的白細(xì)胞降低、髓細(xì)胞微核率提高和SOD活性降低的作用。

(致謝:本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心提供)

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