利用磁珠法結合MALDI-TOF MS進行慢性心衰氣陰虛證血液蛋白質組學研究的方法學探討

楊 鴻，周春喜，李晶哲，馬琰巖，于友華，喻曉春，林 謙，逯金金

(1.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700;2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078;3.美國布魯克公司北京技術支持中心，北京 100081)

近年來，發展迅速的蛋白指紋圖譜技術由于其高靈敏性和高特異性，克服了以雙向電泳、多維液相色譜為核心的傳統蛋白質組學技術在重復性、高通量等方面存在的缺陷，有望成為今后探索中醫證候本質的新研究方法;但在該技術應用過程中仍有許多問題需要進一步解決，如證候樣本的收集和預處理方式、蛋白分離提取方法、實驗體系的穩定性和重復性等因素都會影響實驗分析的結果，最終都需要通過標準化處理來加以解決。本文以慢性心衰氣陰虛證為研究對象，通過應用磁珠法結合基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術分析慢性心衰氣陰虛病人血液蛋白和多肽組分，探索和完善中醫證候蛋白質組學研究中的樣品收集及預處理、分離制備、檢測等方法，為有效獲取中醫證候血液蛋白及多肽圖譜，深入分析中醫證候物質基礎確定可行的技術方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

慢性心衰氣陰虛證(依據《指南》標準，慢性心衰C期(既往或目前有心衰癥狀)患者，依據慢性心衰中醫證候診斷標準診斷有氣陰虛證的患者。年齡30歲～70歲)，18例來自北京中醫藥大學東方醫院，18例對照血樣來自健康志愿者(年齡30歲～70歲)。

1.2 血液樣品收集與預處理

采用EDTA-K3抗凝管、聚丙烯干燥管采集患者治療前或健康志愿者外周血各4ml，室溫靜置1h，4℃ 3000r/min離心10min，分離血漿、血清分裝于500μl EP管中，凍存于－80°C備用。使用前取出血液樣品，冰上融化。

1.3 儀器與試劑

EDTA-K3一次性真空采血管及血清真空采血管，奧地利格雷那公司;銅螯合(IMAC-Cu)磁珠試劑盒，弱陽離子(WCX)磁珠試劑盒，標準品(preptide和 protein混合物)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)，德國Bruker Daltonics公司產品;三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)，美國 Sigma公司產品;Allegra 25R低溫離心機，美國 BECKMAN產品;Autoflex Ш MALDI-TOF/TOF質譜儀，德國 Bruker公司產品。

1.4 血液蛋白及多肽提取方法

按照IMAC-Cu和WCX磁珠試劑盒說明書要求，將CHF氣陰虛證和健康對照組血清與血漿樣品進行分別處理，將洗脫下來的多肽樣品溶液移入干凈的0.5ml樣品管，以備質譜檢測。

1.5 質譜檢測方法

在MALDI靶面上先點1μl洗脫樣品，室溫放干后再點 1μl基質(3mg/ml CHCA，50%ACN，2%TFA)，室溫放干。放入 AutoflexⅢ MALDI-TOF/TOF質譜檢測，條件如下:SmartBeam TM激光源，波長355 nm，正離子模式，掃描相對分子質量范圍1000～10000，激光能量36%，每個樣品疊加1000張譜圖。

1.6 生物信息學處理

質譜數據通過 FlexAnalysis 3.0進行基線的平滑、去背景、標峰處理，再通過ClinProTools軟件進行峰面積歸一化和統計分析。

2 結果

2.1對磁珠結合質譜檢測血液蛋白多肽方法的重復性觀察

表1顯示，對經過WCX磁珠提取處理的同一慢性心衰氣陰虛證患者血漿樣品進行了8個時間點的檢測，選擇高、中、低分子量3個范圍內的10個峰，以質譜峰下面積為強度，計算變異系數進行重復性評估。樣品變異系數范圍在6.65% ～20.62%，重復性較好。

2.2 不同樣品與基質配比對質譜結果的影響

選擇慢性心衰氣陰虛證患者經過WCX磁珠提取的血漿樣本與質譜基質按照 0.2/1、0.4/1、0.6/1、0.8/1、1/1 5種配比比例，分別檢測獲得樣品基質不同配比的質譜圖。結果顯示，在適當范圍內改變樣品與基質比例對結果無影響。

2.3 反復凍融對血液多肽的影響

取慢性心衰患者的同一血漿樣本反復凍融5次，分別進行IMAC-Cu磁珠提取后檢測多肽的質譜圖。實驗結果顯示，無論在出峰數量還是峰的強度等方面，反復凍融5次之內沒有顯著差異。

表1 血漿質譜檢測的重復性考察

2.4 血液不同采集方式和提取方法質譜差異比較

表2顯示，分別檢測慢性心衰氣陰虛證組和健康對照組經IMAC-Cu、WCX磁珠處理的血漿組、血清組樣品，分析血液不同采集方法和不同磁珠試劑盒提取的血液多肽質譜差異。結果顯示，慢性心衰氣陰虛證組和健康對照組在相應檢測范圍內，經IMAC-Cu磁珠提取后獲得的血清質譜峰分別為65、68個，而血漿則為39、32個;經WCX提取后獲得的血清質譜峰分別為75、82個，而血漿則為47、79個。結果顯示，無論是患者還是健康志愿者，不同磁珠處理方法得到的血清樣品的平均質譜峰數量均多于血漿的質譜峰數量;而不同血液處理方法中，WCX磁珠提取血液多肽獲得的質譜峰情況多于IMAC-Cu磁珠處理方法。

表2 不同血液處理和磁珠提取方法的質譜出峰情況

2.5 慢性心衰氣陰虛證與健康對照組間血液多肽質譜圖初步比較

圖1顯示，對于相同血液處理和磁珠提取的慢性心衰氣陰虛證組和健康對照組間血液多肽比較顯示，2組間質譜峰數量接近，但其血液蛋白質譜有明顯差異，如IMAC-Cu提取的患者組與健康對照組的血清質譜二維分布圖中，質荷比為7766Da的質譜峰在2組樣品中的峰強度有明顯差異;初步分析后顯示，根據差異表達蛋白可以很好區分2組間差異。

3 討論

圖1 IMAC-Cu磁珠提取的患者與健康志愿者血清/血漿二維分布圖

近年來，不少中醫藥工作者利用雙向電泳、液相色譜等蛋白質組學技術進行了中醫證候的探索研究［1、2］，然而由于這些技術在重復性、靈敏性、高通量等方面仍有很多問題，影響了其在臨床中的應用與推廣。最近幾年來研究發現，基于磁珠提取的MALDI-TOF-MS技術在發現潛在的生物標志物、識別復雜反應的蛋白質組指紋圖譜方面成效顯著［3-7］，是目前蛋白質組研究中發展最快、最具活力和潛力的質譜研究技術之一，具有高通量、高精確、能夠進行快速分離、制備和鑒定的特性，非常適于中醫證候體系的復雜蛋白質表達模式獲得以及比較分析。本實驗建立了磁珠法結合 MALDI-TOF MS進行慢性心衰氣陰虛證血液蛋白質組學研究的實驗方法，為中醫證候蛋白質組學研究提供了新技術參考。

首先，重復性研究顯示，采用峰面積作為相對強度得到的樣品變異系數范圍在6.65% ～20.62%之間，根據以往文獻［8-11］報道的11% ～30%、3% ～33%，在可接受范圍內，說明重復性較好。在進行血液樣品的前處理時，反復凍融5次之內，無論在出峰數量還是峰的強度等方面，質譜出峰情況沒有顯著差異。但由于反復多次凍融血液樣品易造成蛋白質及多肽沉淀，從而導致質譜丟失部分蛋白及多肽，因此盡量避免反復凍融不超過3次為宜。

在質譜分析過程中，樣品與基質的比例對質譜信號有很大影響。本研究顯示，血漿樣本與基質選擇 0.2/1、0.4/1、0.6/1、0.8/1、1/1 5 種配比比例，質譜圖未見差異，因此在適當范圍內改變樣品與基質比例對結果無影響。

本研究顯示，基于不同的血液處理方法，血漿和血清的蛋白質譜圖存在很大的差異:兩種磁珠提取方法獲得的血清質譜信號數量均高于血漿，這與凝血過程涉及激肽、補體、多種因子的釋放等有關;目前大多數蛋白質組學研究采用的是血清標本，但越來越多的學者主張為反映機體體內的實際情況最好采用血漿，只有在抗凝劑干擾檢驗結果的情況下，才考慮采用血清［12-14］。當前仍沒有足夠的證據支持蛋白質組學研究中應該選擇血漿或是血清作為研究材料，因此在研究中若將血清和血漿進行平行對比和印證分析，可以增加結論的可靠性。

在蛋白質分離提純中，具有不同的化學和生物學表面修飾的磁珠能被不同的蛋白質識別和可逆結合，選用哪種磁珠進行分離對研究結果的影響也很大。我們的實驗結果顯示，通過弱陽離子磁珠提取獲得的血液質譜信號要多于銅螯合磁珠，表明弱陽離子磁珠可以從樣品中篩選出更多的蛋白質，為尋找到CHF氣陰虛證差異蛋白質提供了更大的可能性。具體研究中可以根據實驗研究目的的不同，如為了分離盡可能多的蛋白還是僅僅分離樣品中某些感興趣的蛋白，來選擇合適的磁珠試劑進行提取。

磁珠結合MALDI-TOF質譜技術檢測血液蛋白及多肽譜的整個實驗體系穩定、可靠、重復性好，適用于中醫證候蛋白質組學的研究。

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