脊髓繼發性損傷大鼠動物模型的制作

孫莉莉 周酈楠

急性脊髓損傷后開始時常為不完全性，最后結果常為兩種損害機制引起:原發性脊髓損傷和繼發性脊髓損傷(SSCI)。繼發性脊髓損傷為傷后幾小時至幾天發生的一系列損傷激活的自身破壞過程，使最初病灶周圍原來完整的組織發生自身破壞性病變，周圍神經功能損害逐漸發展。所產生的脊髓損害遠遠超過了原發性損傷[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SPF大鼠60只，電子顯微鏡，化學試劑。

1.2 實驗動物分組 本實驗選用雄性健康SPF大鼠60只，體重260～300 g，正常對照組:20只。動物模型組的組織化學染色:20只。動物模型組的電子顯微鏡組:20只。

1.3 實驗方法

1.3.1 繼發性脊髓損傷大鼠模型制備 1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉動物(30 mg/kg)，俯臥位固定于立體定位儀上。以T10為中心暴露上下位錐板，咬除椎板，保持硬脊膜完整。在T10階段節段脊髓表面墊一曲度與脊髓表面一致的3 mm×8 mm塑料片，用30 g重物垂直壓迫T10節段脊髓10 min，逐層縫合肌肉皮膚。符合以下條件的大鼠歸入損傷組:壓迫時身體痙攣性顫動、尾巴痙攣性擺動、雙下肢及軀體回縮樣撲動;壓迫后硬脊膜內充血或水腫，雙下肢呈遲緩性癱瘓，斜板實驗測定最大角度＜30°。對照組大鼠只暴露脊髓。術后不同時間點處死動物，4%多聚甲醛灌注固定，無菌條件下取損傷節段脊髓組織約1.0 cm，液氮保存或石蠟包埋。

1.3.2 組織染色標本的取材 對實驗動物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/kg)腹腔麻醉后開胸，經左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的生理鹽水500 ml，同時剪開右心耳。繼用0.1 m磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實驗動物的脊髓組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進行后固定大約2 h，之后將實驗動物的脊髓組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經水包埋，恒冷箱連續橫切片，片厚20 μm。經OCT包埋，恒冷箱連續切片，片厚16 μm，-70℃保存備用。

1.3.3 電子顯微鏡組織標本的取材 在1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔麻醉下，用含1%肝素鈉生理鹽水200 ml快速沖洗后，用2%多聚甲醛及2.5%戊二醛的0.1 m磷酸緩沖液250 ml灌流固定，灌流后立即取腦，切取脊髓組織塊置于4℃，2.5%戊二醛中固定24 h，經1%鋨酸固定1 h后，常規脫水，Epon812包埋，L.K.B超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，日立H-600透射電鏡觀察并拍片。

1.3.4 尼氏染色 冰凍切片吹干，經PBS漂洗5 min 3次，將切片置入1%甲苯胺藍溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5 min 3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 尼氏染色結果 正常對照組大鼠脊髓前角細胞的尼氏染色切片上，神經元數量較多，排列緊密，形態完整，細胞漿有內尼氏體。

動物模型組大鼠脊髓，肉眼可見大鼠脊髓損傷局部組織充血。鏡下可見SCCI后3～6 h損傷局部神經元核固縮，胞體縮小，胞質深伊紅染色，成為紅色是神經元。傷后1～3 d，軸突腫脹，出現空泡，白質內神經髓鞘散亂、崩解破裂。傷后3～7 d膠質細胞增生明顯，可見衛星現象及鬼影細胞。傷后14 d，損傷段脊髓變細部分灰質崩解壞死，可見囊腔形成。正常神經元數量明顯增多，細胞豐滿，泡漿內尼氏體豐富。

2.2 透射電鏡結果 動物模型組大鼠脊髓前角神經元細胞:核皺縮、核膜部分溶解、消失;線粒體腫脹、嵴紊亂甚至缺失;內質網擴張、脫顆粒;高爾基體扁平囊腔擴張;突觸數量減少、前后膜融合、突觸小泡不清或出現聚集。

根據尼氏染色及電鏡觀察說明繼發性脊髓損傷大鼠模型制備成功。

[1]Shoshani T，Faerman A，Mett I，et al.Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-responsive gene，RTP801，involved in apoptosis．Mol Cell Biol，2005，22(7):2283-2293．