γ射線對舞毒蛾蟲卵處理效果的研究

李景奎，戚大偉，周志強，林海峰

（東北林業大學理學院，哈爾濱 150040）

舞毒蛾（Lymantria dispar）是一種世界性害蟲，它具有分布廣、食性雜、危害重、幼蟲隨風遷移的特點，主要危害針闊葉樹種和果樹，嚴重影響樹木的正常生長，給林業生產帶來巨大經濟損失[1-4]。傳統的處理方法是化學方法，但化學農藥大量使用嚴重污染了環境，破壞生態平衡，導致害蟲產生了嚴重的抗藥性。為了更有效地控制舞毒蛾的危害，保護森林生態環境，需要采用化學防治、生物防治、物理防治等多種綜合防治措施[5]。其中，γ射線輻照滅蟲就屬于物理防治的一種，γ射線對生物有機體的作用可使其發生一系列的生物化學變化，這種變化直接影響生物有機體的新陳代謝和生命活動，當生物體內γ射線積累到一定劑量時，使機體遭到損傷直至死亡[6-8]。

臺盼藍是一種酸性活體染料，它的膠粒表面帶有陰離子，能使具有陽離子的部分染色。正常的活細胞，細胞膜結構完整具有選擇透過性能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入細胞內；死細胞或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色。因此，用臺盼藍染色后在顯微鏡下觀察，死細胞染成藍色，活細胞不著色[9]。本試驗以林木害蟲舞毒蛾蟲卵為試驗材料，用不同劑量的γ射線照射舞毒蛾蟲卵，觀察照射后蟲卵孵化率的宏觀變化情況和活體染色后蟲卵細胞的微觀變化情況，為物理滅蟲效果的檢驗提供新的方法，對物理滅蟲的研究和實際應用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗蟲卵

8月下旬在東北林業大學校園內采集舞毒蛾卵塊，此時蟲卵已完成胚胎發育，卵內為處于滯育期的準備越冬的舞毒蛾幼蟲，挑選飽滿、圓潤舞毒蛾卵塊放置在4℃冰箱中。

1.1.2 試驗試劑

2%～3%福爾馬林溶液，0.1 mol·L-1（pH 7.0）PBS緩沖液（配置方法：A液：2.76 g NaH2PO4·H2O，加蒸餾水至100 mL。B液：5.36 g Na2HPO4·7H2O，加蒸餾水至100 mL。取16.5 mL A液，33.5 mL B液，8.5 g NaCl用蒸餾水稀釋至100 mL），1%臺盼藍（配置方法：將臺盼藍溶于生理鹽水，配成0.5%～1%溶液，調pH到7.0～7.2），0.25%胰蛋白酶（配置方法：0.25 g胰蛋白酶粉，加D-Hanks液100 mL完全溶解，過濾除菌，調pH到7.4，密封，4℃保存），D-Hanks液（配置方法：8 g NaCl，0.40 g KCl，0.06 g Na2HPO4·H2O，0.06 g KH2PO4，0.35 g NaHCO3，0.02 g酚紅以上成分依次溶于500 mL三蒸水中，完全溶解后，補足三蒸水至1 000 mL）。

1.1.3 試驗儀器

同中心回轉式60Co治療機（FCC-7 000型，輻照劑量率為1.615 cGy·s-1，山東新華醫療器械股份有限公司出產），恒溫水浴箱，普通顯微鏡，解剖鏡，染色缸，吸管，脫脂棉，培養皿，濾紙，燒杯，載玻片，蓋玻片等。

1.2 方法

1.2.1 試驗前期處理

將蟲卵用手輕輕揉搓，使之分成小顆粒的卵（不要揉碎卵粒），用吹風機使碎末和不成熟的蟲卵與成熟蟲卵分離。并用適量蒸餾水清洗，將洗凈后的蟲卵放在2%～3%的福爾馬林溶液中進行消毒處理6～10 min后，再用蒸餾水清洗3遍，洗掉殘余的福爾馬林溶液。在干凈的培養皿中放入一層脫脂棉，滴入少量的蒸餾水，并在上面蓋一層濾紙，最后將清洗好的蟲卵放在培養皿中。輻照試驗分為宏觀試驗和微觀試驗兩部分，宏觀試驗研究不同劑量的γ射線照射對舞毒蛾孵化率的影響，根據試驗需要把培養皿分成五個輻照組和一個標準組，每組舞毒蛾卵粒為400只，在培養皿上分別貼上標簽，標簽分別為γ1、γ2、γ3、γ4、γ5，試驗采用哈爾濱市第一醫院放射科60Co源輻照舞毒蛾蟲卵，輻照劑量分別為100、300、400、500和700 Gy，每組輻照試驗重復3次，將輻照后的蟲卵進行孵化，記錄各組平均孵化蟲卵數目，最終得到孵化率的平均值，具體的輻照參數設定與順序排列如表1所示，標準組的蟲卵沒有經過任何電磁波照射，在室溫的條件下自然孵化，用來作為試驗參照標準[10-11]；微觀試驗是利用臺盼藍染色舞毒蛾蟲卵細胞，研究蟲卵細胞的微觀變化情況，具體輻照參數設定與宏觀試驗相同。

1.2.2 臺盼藍微觀染色方法

將蟲卵去殼，取出的幼蟲放入PBS液中漂洗2～3 min；再將幼蟲解剖，去除幼蟲表皮；用0.25%胰蛋白酶置于37℃水浴中消化至幼蟲細胞出現間隙；滴加1%臺盼藍染液在室溫下浸染2 min；甘油封片，用中性樹膠封固壓片，最后置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 數據分析

用計算機統計軟件Origin 7.5對不同輻照劑量下的孵化率進行回歸分析，建立數學方程式，得到幼蟲孵化率隨γ射線照射劑量的變化規律數學模型。

2 結果與分析

2.1 幼蟲孵化率宏觀試驗結果

由表1可以看出，經過γ射線照射的試驗組比標準組孵化率低，隨著照射劑量的增加，幼蟲孵化率呈明顯下降趨勢。γ1組幼蟲孵化率變化不大，幼蟲孵化率也比標準組低14.25%，當輻照劑量為300 Gy時，孵化率降至為16.50%，比標準組降低近70%，當輻照劑量為500 Gy時，孵化率已經低于5%，當輻照劑量為700 Gy時，孵化率降至1%，幾乎沒有蟲卵孵化出來，可使蟲卵全部致死。從表1還可以看出，舞毒蛾蟲卵的孵化率受γ射線劑量影響很大，當輻照劑量低于300 Gy時，孵化率變化明顯，孵化率急劇下降，輻照生物效應顯著。

表1 幼蟲孵化率宏觀試驗結果Table 1 Macroscopic experiment results of the larva's hatching rate

2.2 孵化率變化規律的數據分析

用計算機統計軟件origin 7.5對不同輻照劑量下的孵化率進行回歸分析,結果輻照劑量和孵化率的關系符合多項式的五次方曲線方程。其方程中，Gy：輻照劑量；an：參數；f：不同輻照劑量下蟲卵孵化率的函數。其方程如下，參數為a0=86.5，a1=0.07832，a2=-0.0031，a3=0.00001，a4=-1.248×10-8，a5=5.3373×10-12。

幼蟲孵化率隨γ射線照射劑量的變化規律回歸曲線如圖1所示。

圖1 幼蟲孵化率隨γ射線照射劑量的變化規律Fig.1 Change regulation of larva's hatching rate with γ-ray irradiation dose

2.3 臺盼藍染色的微觀試驗結果

臺盼藍染色幼蟲細胞的微觀試驗結果如彩版Ⅰ所示，標準組（未輻照）的幼蟲細胞均未著色，γ 1組（100 Gy）的幼蟲細胞有小部分呈藍色，γ2組（300 Gy）的幼蟲細胞有大部分明顯呈藍色，γ3組（400 Gy）、γ4組（500 Gy）、γ5組（700 Gy）的幼蟲細胞幾乎全部呈藍色。臺盼藍染液使幼蟲死細胞著色，能鑒別出幼蟲細胞的死活狀態。由此可知，當輻照劑量為100 Gy時，幼蟲體內細胞所受損傷較輕；當輻照劑量大于300 Gy時，幼蟲體內死細胞比例迅速上升，活細胞比例極小，而此時幼蟲的死亡率也在80%以上，進一步證明細胞存活率與γ射線輻照劑量存在劑量關系，這與宏觀孵化率的試驗所得結論吻合良好。當細胞損傷或死亡時，臺盼藍染料可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色。而活細胞能阻止臺盼藍染料進入細胞內，借此可以鑒別死細胞與活細胞，從實驗結果中可以看到γ射線輻照造成了蟲卵細胞損傷或死亡，可見，利用臺盼藍染色可以檢測γ射線輻照劑量對蟲卵細胞活性影響[12]。

3 討論與結論

γ射線輻照劑量對蟲卵孵化率、染色體損傷程度、細胞存活率都有很大影響，隨著γ射線輻照劑量的增加，幼蟲孵化率逐漸降低，幼蟲細胞的死亡數量逐漸上升；總體上看，宏觀試驗和微觀試驗所得結論吻合良好；當γ射線輻照劑量超過300 Gy時，幼蟲孵化率變化最為明顯，幼蟲細胞也幾乎全部染上藍色，輻照生物效應顯著。當輻照劑量在300～400 Gy時，既可以在保證滅蟲效果，又可以降低輻照防護難度。臺盼藍染色是一種簡單、有效、實用的方法，可以利用臺盼藍染色檢驗物理滅蟲的生物學效應，把物理滅蟲宏觀效果和微觀細胞染色有機結合起來，為檢驗物理滅蟲提供新的方法。

由于受到試驗儀器條件和舞毒蛾生長周期（一年一代）等方面的限制，本文只對γ射線對舞毒蛾蟲卵處理效果試驗研究，從幼蟲孵化率的宏觀變化情況和經過臺盼藍活體染色后幼蟲細胞的微觀變化情況來闡述物理滅蟲的效果。為了探討電磁輻射對舞毒蛾生長發育的影響，需要從電磁波理論角度研究各種電磁波與生物體的相互作用，及輻照后生物體產生的物理效應、化學效應、生物效應等揭示輻照滅蟲的機理。還需要對微波，X射線，紫外線，紅外線，超聲波，重離子射線等其他物理滅蟲手段進行深入研究，將照射后的舞毒蛾蟲卵進行人工培育和飼養，直到羽化為成蟲。宏觀方向探討射線輻照對蟲卵的孵化，幼蟲的死亡，化蛹，羽化等各階段的影響，微觀方向可以利用熒光探針技術從微觀角度研究輻照蟲卵細胞變化情況，構成細胞的主要細胞器，如細胞核等與正常昆蟲的差別，以及輻照害蟲體內DNA、RNA損傷情況，將物理滅蟲方法和熒光探針檢測技術結合起來，使熒光探針技術能夠應用在物理滅蟲效果的微觀檢測中。物理滅蟲在目前科學領域是一個有待發展、又有廣闊前景的研究領域，可以彌補傳統的化學滅蟲的缺陷，為病蟲害防治開辟新的渠道[13-15]。

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