測(cè)定豬肉中土霉素及金霉素殘留的HPLC法建立

智若嵐，劉中成，李廣興，張瑞莉*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市獸藥飼料監(jiān)察所，哈爾濱 150040）

近年來，為有效預(yù)防和治療禽畜、魚類等疾病，獸藥及化學(xué)藥品被廣泛地應(yīng)用做飼料添加劑，以促進(jìn)其生長速度，控制其生殖周期和繁育能力[1]。土霉素和金霉素是我國應(yīng)用最廣、應(yīng)用時(shí)間最長的動(dòng)物保健性抗生素，曾經(jīng)為我國的“菜籃子工程”保駕護(hù)航，但是這兩種抗生素在動(dòng)物性食品中的殘留不僅危害人體健康，而且更為嚴(yán)重的是動(dòng)物性食品中殘留較低濃度的土霉素、金霉素容易誘導(dǎo)各種致病菌產(chǎn)生耐藥性，不利于兩種藥物對(duì)人類和畜禽類疾病的治療。隨著土霉素、金霉素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的不斷應(yīng)用，其殘留問題已經(jīng)引起社會(huì)及有關(guān)部門的高度重視。因此，探究科學(xué)、快速的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中土霉素和金霉素方法對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展有著重要意義。本試驗(yàn)通過建立高效液相色譜方法，檢測(cè)豬肉中土霉素和金霉素的殘留量,為監(jiān)控動(dòng)物源性食品中土霉素和金霉素藥物殘留提供安全可靠的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

1525泵高效液相色譜儀：紫外檢測(cè)器2487、色譜工作站、自動(dòng)進(jìn)樣器717和柱溫箱（美國Waters公司）；電子天平（日本島津公司）；高速離心機(jī)（上海醫(yī)用儀器分析廠）；超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）及抽濾器（天津恒奧特科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥物與標(biāo)準(zhǔn)品

土霉素對(duì)照品（30305-200519，純度為87.2%）、金霉素對(duì)照品（900288，純度為96.9%），以上兩種對(duì)照品均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

土霉素、金霉素（OTC、CTC）標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取土霉素11.47 mg、金霉素10.32 mg，分別用0.1 mol·L-1鹽酸溶液、雙蒸水溶解并定容至10.00 mL。

土霉素、金霉素（OTC、CTC）標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取土霉素1.00 mL、金霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.00 mL，定容至10.00 mL，搖勻。此溶液中含土霉素0.1 mg·mL-1、金霉素0.2 mg·mL-1。

1.3 空白樣品

試驗(yàn)中所用豬肉購自超市。將豬肉切碎，放于組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，作為空白樣品，-20℃保存。

1.4 主要試劑及配制

乙腈為色譜純，5%高氯酸50 mL為樣品提取液，鹽酸為分析純，磷酸二氫鈉為分析純。0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液：稱取1.562 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶于蒸餾水中，定容到10.00 mL，過0.45 μm的濾膜，用以配制流動(dòng)相。5%高氯酸：取70%的高氯酸7.14 mL，加雙蒸水至100 mL。

1.5 方法

1.5.1 色譜條件

色譜柱為ODS-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測(cè)波長：355 nm，柱溫：室溫，流動(dòng)相：乙腈+0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（pH 2.5用30%硝酸調(diào)節(jié)35∶65），進(jìn)樣量是 10 μL。

1.5.2 樣品處理及分析檢測(cè)

稱取絞勻的豬肉樣品5.01 g，置于50 mL錐形燒瓶中，加入25 mL的5%高氯酸，在振蕩器上震蕩10 min，移入離心管，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，重復(fù)兩次，進(jìn)行濃縮后過0.45 μm的濾膜，取10 μL進(jìn)樣，記錄峰高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出含量。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的測(cè)定

稱取豬肉樣品7份，每份為5.00 g（精確到±0.01 g），分別加入土霉素、金霉素的工作液0、25、50、100、150、200、250 μL（含土霉素、四環(huán)素 各為 0、2.5、5.0、10.0、 15.0、20.0、25.0 μg，含金霉素 0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg），按“1.5.2樣品處理”方法操作，以峰高為縱坐標(biāo)，以抗生素含量為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5.4 殘留量計(jì)算

試樣中土霉素、金霉素的殘留量：

式中，X為樣品中土霉素、金霉素的殘留量（mg·kg-1）；M為試樣質(zhì)量（g）；H為樣品中土霉素、金霉素的峰高。

1.5.5 檢測(cè)限

取空白豬肉組織，做10個(gè)平行，按照“1.5.2”項(xiàng)的方法處理，測(cè)得基線噪音值，并求其平均值。按照信噪比S/N≥3確定為檢測(cè)限（LOD）。

1.5.6 添加回收率和變異系數(shù)的測(cè)定

稱取空白豬肉組織5.01g，置于50 mL離心管中，設(shè)高、中、低三個(gè)添加水平，按“1.5.2”項(xiàng)的方法處理，取10 μL進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣5次。根據(jù)峰面積計(jì)算添加回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜選擇和分離

樣品添加土霉素和金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間為0.581和1.552 min，空白組織樣品在該時(shí)間處無雜峰干擾（色譜圖見圖1、2）。

圖1 添加土霉素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品的豬肉色譜圖Fig.1 Chromatogram of pork with standard preparation of oxytetracycline and chlorotetracycline

圖2 空白豬肉色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank pork without oxytetracycline and chlorotetracycline

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和線性范圍

空白樣品中添加土霉素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液后的標(biāo)準(zhǔn)曲線 0.1～1.0 μg·mL-1和 0.2～2.0 μg·mL-1呈線性關(guān)系，R2依次為0.9997、0.9955。說明本試驗(yàn)中土霉素、金霉素在0.1～1.0 μg·mL-1和0.2～2.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于樣品的定量檢測(cè)。回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

表1 豬肉空白樣品中添加土霉素、金霉素的線性關(guān)系Table 1 Standard curve equations and correlative coefficients of HPLC analysis of oxytetracycline and chlortetracyline in pork

圖3 添加土霉素、金霉素豬肉的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of oxytetracycline and chlorotetracycline in pork

2.3 檢測(cè)限

依據(jù)信噪比S/N≥3為檢測(cè)限，土霉素、金霉素的最低檢測(cè)限分別為20、10 μg·kg-1。

表2 豬肉中土霉素、金霉素的添加回收率和變異系數(shù)Table 2 Coefficients of recovery and variability of oxytetracycline and chlorotetracycline in pork(n=5)

2.4 添加回收率和變異系數(shù)

豬肉中添加各濃度的土霉素、金霉素的回收率及變異系數(shù)見表2。

根據(jù)我國農(nóng)牧發(fā)[2003]1號(hào)文件規(guī)定，對(duì)獸藥殘留檢測(cè)方法不同添加濃度的回收率原則要求，回收率范圍應(yīng)為70%～110%，動(dòng)物源性食品中獸藥殘留實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范要求生物樣品，低濃度點(diǎn)的變異系數(shù)要小于15%。由表2可以看出，本試驗(yàn)建立的土霉素和金霉素的殘留檢測(cè)方法比較可靠，回收率和變異系數(shù)均能達(dá)到殘留分析的要求。

3 討論與結(jié)論

3.1 國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)土霉素及金霉素

已有很多文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用HPLC法檢測(cè)土霉素、金霉素在動(dòng)物組織中的殘留量，根據(jù)色譜條件不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線不同，檢測(cè)的結(jié)果也不一致[2-6]。在本試驗(yàn)中，根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，在此工作條件下測(cè)定土霉素及金霉素的殘留量方法較好，但檢測(cè)中仍存在一定的問題（如標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度配制應(yīng)范圍更廣、流動(dòng)相的配制比例還要更精確），有待于進(jìn)一步的調(diào)整。

3.2 豬肉樣品的處理

本試驗(yàn)的樣品處理采用的是國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的方法，用5%的高氯酸來進(jìn)行樣品提取，能夠把豬肉中土霉素、金霉素很好的分離出來，離心時(shí)把變性的蛋白和脂類沉淀分離。并根據(jù)國標(biāo)檢測(cè)方法，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，采用乙腈和0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉做流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液均無干擾峰，分離較好。

3.3 回收率、變異系數(shù)、檢測(cè)限試驗(yàn)

回收率可以看出從樣品的處理到檢測(cè)的一系列過程中藥物的損失程度，是衡量試驗(yàn)方法是否可靠的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，回收率越高則表明試驗(yàn)方法越可靠。本試驗(yàn)通過不同濃度添加水平的重復(fù)測(cè)定，在線性范圍內(nèi)測(cè)定土霉素和金霉素均得到較好的回收；變異系數(shù)也是考察試驗(yàn)過程中的損失情況，但不同于回收率的是，其反映生物樣本從制備、保存到測(cè)樣各個(gè)環(huán)節(jié)的總誤差，本試驗(yàn)的回收率和變異系數(shù)結(jié)果說明本試驗(yàn)的檢測(cè)方法可行[7]。

在獸藥殘留分析中，可以根據(jù)動(dòng)物性食品中獸藥的最高殘留限量來規(guī)定檢測(cè)方法的檢測(cè)限，一般來說，檢測(cè)方法的檢測(cè)限必須低于相應(yīng)的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。我國規(guī)定了四環(huán)素類抗生素在動(dòng)物源食品中的最高殘留限量（MRL）為肌肉組織100 μg·kg-1[8-9]。本試驗(yàn)的檢測(cè)限低于最高殘留限量（MRL），說明本試驗(yàn)方法可行。

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