超高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬血清中泰樂菌素殘留的建立

崔 陽，王 冰，徐 剛，邊 棟，李艷華*

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030）

泰樂菌素是一種畜禽專用大環內酯類抗生素，作為促進生長用的添加劑在國內養豬業中已廣泛應用。在我國，泰樂菌素仍然屬于限制使用的藥物飼料添加劑。然而2006年歐盟成員國全面禁止使用抗生素作為促生長劑。但對于活體動物出口的檢疫，無法采用動物組織或臟器直接測量，因而進行血液中泰樂菌素含量的測量來標示泰樂菌素在體內組織中的殘留情況。到目前為止，我國尚無有關豬血清中泰樂菌素殘留的可靠分析方法。報道的檢測大環內酯類的方法主要有高效液相色譜法[1－2]、氣/質聯用法[3]、液/質聯用法(LC/MS或LC－MS/MS)[4－10]。

本試驗采用超高效液相色譜串聯三重四級質譜（UPLC－MS/MS）技術對血清樣品中的泰樂菌素進行分析?？朔搜迦恿啃〉南拗?，且MS具有高靈敏度、高選擇性的特點，可以在極低的濃度下進行精確的定量，因此本試驗可以對血清中微量泰樂菌素進行快速鑒別和測定，同時也對泰樂菌素在豬體內的藥物代謝動力學研究提供了檢測方法。豬血清中泰樂菌素的檢測限達到0.2 ng·mL－1，回收率及精密度結果滿意。豬血清中泰樂菌素的檢測方法，作者未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑與標準品

甲醇－HPLC級（Dimammd），乙腈－HPLC級（Fisher），泰樂菌素標準品（Sigma），乙酸、乙酸銨－分析純（科密歐），SEP－Vac C18固相萃取柱3 mL，200mg填料（Waters），去離子水（Milli－Q），5種不同來源的空白血清樣品（香坊試驗豬場）。

1.1.2 儀器

Water ACQUITY UPLC超高壓高效液相色譜儀串聯Quattro Premier XE三重四級質譜。質譜采用電噴霧電離原，MassLynx4.1的軟件控制系統。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH－C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈（A）和0.2%乙酸（B）為流動相梯度洗脫（見表1）。流速0.25 mL·min－1，柱溫30℃，5 μL進樣。

表1 超高效液相色譜分析的流動相的組成與梯度Table 1 Composition and gradient of the mobile phase for UPLC analysis

1.2.2 質譜條件

采用ESI+模式，毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓25 V；源溫度110℃；脫溶劑氣溫度350℃；錐孔氣流量50 L·h－1；脫溶劑氣流量550 L·h－1。碰撞氣體為氬氣，碰撞室壓力3.3×10－3mbar，定性和定量的離子及其碰撞能量等質譜條件見表2。泰樂菌素離子碎片及斷裂方式見圖1。

圖1 泰樂菌素離子碎片質譜圖Fig.1 Mass spectra of the Tylosin

表2 泰樂菌素的定性和定量離子質譜條件Table 2 Precursor ions and product ions of the Tylosin in the positive ion mode

1.2.3 標準溶液的制備

準確稱量20.00 mg泰樂菌素標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，配置成濃度為200 μg·mL－1標準品儲備液1，于4℃冰箱保存待用。移取1.0 mL儲備液Ⅰ至100 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻線，配置成濃度為2 μg·mL－1標準品儲備液Ⅱ。將儲備液用用乙腈－0.2%乙酸（30∶70，V/V）溶液分別稀釋為0.5、1、5、10和50 ng·mL－1等系列標準品工作液。

1.2.4 樣品的提取和凈化

準確量取0.5 mL血清至25 mL離心管中，加入2 mL 0.05 mol·L－1pH4 的乙酸銨溶液，加入 0.5 g NaCl，準確移取5 mL乙腈加入離心管中。旋渦振蕩5 min，2 600 r·min－1離心 3 min。離心后取上清液2.5 mL置于另一15 mL離心管中，50℃氮吹至盡干。

采用Sep－Vac C18固相萃取柱進行凈化。3 mL甲醇活化固相萃?。⊿PE）小柱，5 mL水平衡小柱，用2.5 mL 0.05 mol·L－1pH 4的乙酸銨溶液溶解濃縮的樣品通過固相萃取柱，再用每次1 mL的乙酸銨溶液2次重復溶解樣品，通過SPE小柱。待樣品全部經過SPE小柱后，減壓抽干30 s。用5 mL 5%氨水－甲醇溶液洗脫，洗脫液接于15 mL離心管中，50℃氮吹至盡干。

濃縮后的樣品殘渣，用1 mL流動相－乙腈：0.2%乙酸（30∶70）震蕩溶解，過0.22 μm濾膜，轉移至進樣瓶。

2 結果與分析

2.1 選擇性

試驗分別選用了五組來自不同源豬的血清進行分析，結果表明經過（1.2.4）樣品的提取和凈化處理后，血清中并沒有干擾物質對此檢測方法造成影響，且該血清可作為空白血清進行試驗。標準品圖和血清樣品圖見圖2。

圖2 含有血清基質的標準品圖及空白血清樣品圖Fig.2 MRM chromatogram of porcine serum and added with Tylosin standard

2.2 標準曲線與線性范圍

選取0.5、1、5、10和50 ng·mL－15個濃度配置成以血清為基質的標準溶液。平行做兩組進行測定，以藥物濃度（ng·mL－1）為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。可以看出泰樂菌素在0.5～50 ng·mL－1范圍內呈現良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.9994。線性方程及相關系數見表3。

表3 豬血清中泰樂菌素標準曲線Table 3 Standard curve of Tylosin in swine serum

2.3 靈敏度與精密度

對于測定豬血清中的泰樂菌素的精密度與重現性的考察，將配置好的一定濃度血清為基質的標準品溶液，根據特征離子質量色譜峰信噪比（S/N）＞3為方法最低檢出限，為 0.06 ng·mL－1，（S/N）＞10 為方法最低定量限為0.2 ng·mL－1。在同一天內對不同添加濃度的泰樂菌素對照品血漿各5份進行分析測定；連續5 d對不同添加濃度的泰樂菌素對照品血漿進行測定。日間與日內RSD均＞13.5%，結果見表4。

2.4 回收率

添加一定量標準溶液于0.5 mL空白血清樣品中，3個水平的標準添加的質量濃度分別相當于5、10和50 ng·mL－1的殘留量，每一濃度水平下作5個平行樣。添加后按照“2.3和2.4”節所述步驟進行提取、凈化，UPLC－MS/MS測定，回收率在73%～84%之間。結果見表4。

表4 豬血清中泰樂菌素的日間、日內差異和回收率結果（n=5）Table 4 Within-day and inter-day accuracy and recovery of Tylosin tartrate in porcine serum(n=5)

3 討論

在檢測方法選擇上，內標法是相對準確的方法，但是泰樂菌素的同位素－D內標難以獲得。若選擇其他物質作為內標化合物的話，即使是結構相近，但是ESI接口方式本身就造成了不同化合物間的電離程度不同，因而本試驗采用了混有血清基質的標準品以基質標的方式，外標法進行定量。大量樣品分析時，與內標法相比，本方法在樣品的預處理上較簡單，同時節省了使用內標化合物的成本。

本試驗采用5 μg·mL－1泰樂菌素標準溶液在電噴霧正離子模式下進行母離子全掃描，確定準分子離子[M+H]+，優化錐孔電壓。然后以準分子離子為母離子對其子離子進行全掃描，選取豐度較強的3對子離子，優化其碰撞能量、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等質譜參數。由于樣品基質會對泰樂菌素電離造成影響，當預處理方法完成后，采用混有血清為基質的標準溶液經質譜分析，再最終選擇出豐度最強的兩對子離子。母離子[M+H]+（m/z 916.9），兩個子離子碎片為失去部分糖結構的[M+H]+（m/z 772.4），和質子化的結構碎片[M+H]+（m/z 174.4）作為MRM參數。

采用ESI+方式進行監測離子，酸性流動相有利于泰樂菌素的電離。乙酸銨作為流動相能很好的控制待分析物的峰型，但與乙酸相比抑制了泰樂菌素電離。為了獲得更高的靈敏度，實驗選用了0.2%乙酸作為流動相。采用ACQUITY UPLC BEH C18柱分離樣品，1.7 μm的填料顆粒在分離血清樣品時，由于樣品基質復雜，使用等度洗脫時，易造成內源性物質在色譜柱上的蓄積從而降低色譜柱效影響色譜峰峰形，所以在本試驗中選擇梯度洗脫，減少內源性物質的蓄積使得峰形更銳，并且使色譜柱的壽命大大增長。

試驗在前處理過程中，對血清樣品的凈化采用了固相萃取方式。泰樂菌素為中等極性，因而試驗選用采用Sep－Vac C18柱和Osisa HLB柱進行樣品凈化，采用乙酸銨溶解樣品通過小柱，偏酸性的環境有利于泰樂菌素在C18這種填料的固相萃取小柱上吸附。C18為反向柱，可利用其溶劑強度的變化控制泰樂菌素在小柱上的保留，實驗中選用洗脫能力極性由弱到強的甲醇和乙酸乙酯作為洗脫液，但其效果不佳，改換為堿性甲醇后回收效果很好。其可能原因是堿性環境破壞了泰樂菌素的配體結合形式，使其分子極性增強，在C18柱上的保留行為發生改變而容易被洗脫。與C18小柱相比HLB具有強吸附作用，但同時必須以更強洗脫強度的進行洗脫，使用兩種SPE小柱的結果無明顯差別，因而選用了價格較低的Sep－Vac C18柱進行試驗。

4 結論

本文建立了一種超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）法對豬血清中泰樂菌素進行檢測，通過對檢測指標的考察，試驗方法檢測限達到0.2 ng·mL－1，有較好的準確度和精密度，方法回收率符合檢測要求。本方法樣品的提取和凈化操作簡單，可以對血清中微量泰樂菌素進行快速鑒別和測定。能夠建立一種快速、簡單、廉價、高效和嚴格的方法來檢測豬血清中的泰樂菌素殘留情況，并為藥物代謝動力學提供了可靠的檢測方法。

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