甲氧芐啶與中藥復方聯用抗菌增效作用的研究

王 新，崔一 ，邵 紅，韓鐵鎖

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

中藥抗菌作用的研究是在中藥治療感染性疾病確有療效的基礎上進行的[1]。由于抗生素的廣泛應用，曾使中藥抗菌作用的研究不被醫學界所重視。但細菌耐藥性的普遍產生和日益被關注的藥物殘留問題，為中藥抗菌作用的研究提供了契機。關于中藥抗菌作用的研究資料較多，其中單味中藥抗菌作用的研究資料明顯多于中藥復方[2]，這與中藥多是復方應用的客觀現狀不符。加強中藥復方抗菌作用的研究才符合臨床應用的需求。甲氧芐啶為化學合成的抗菌增效劑，對多種抗生素和中藥具有抗菌增效作用[3－4]。目前，關于甲氧芐啶對中藥抗菌增效作用的研究較少，且僅為定性研究。因此定量研究甲氧芐啶對中藥抗菌增效作用，為研發防治畜禽疾病的中西藥復方制劑奠定了堅實的基礎，對有效地控制畜禽細菌性疾病和促進中藥在獸醫臨床上的廣泛應用，具有重要的理論意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

沙門氏菌（CMCC50115）、大腸桿菌（ATCC35218）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）均購于中國獸醫藥品監檢所。

1.1.2 藥物

甲氧芐啶購于太原市康瑞寶獸藥制造有限公司，批號：20080503。黃芩、連翹、板藍根和蒲公英4味中藥購于大慶市福瑞邦醫藥公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物溶液的制備

精確稱量128 mg的甲氧芐啶制成1 280 μg·mL－1的甲氧芐啶藥液100 mL。采用水提醇沉法制備含2 g·mL－1生藥的中藥提取液，將黃芩、板藍根、蒲公英和連翹的提取液按1∶1∶2∶1比例配伍組成中藥復方（含生藥量為625 mg·mL－1），流通蒸汽滅菌30 min，4℃冰箱保存備用。

1.2.2 菌種活化

采用常規方法進行細菌活化，將菌液稀釋至濁度為1×107cfu·mL－1，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 中藥復方和甲氧芐啶的體外抗菌試驗

采用試管二倍稀釋法[5]測定甲氧芐啶及中藥復方對3種細菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.4 中藥復方與甲氧芐啶聯用體外抗菌增效試驗

將中藥復方用無菌肉湯稀釋到2 MIC濃度，將甲氧芐啶藥液稀釋到640、320、160、80和40 μg·mL－1濃度。取7只已編號滅菌試管，1～5號管分別加入5種甲氧芐啶藥液1 mL和2 MIC的中藥復方1 mL，6號管中加入2 MIC的中藥復方和肉湯各1 mL，7號管為對照管加入肉湯2 mL；然后每個試管中加入2×106cfu·mL－1細菌懸液0.1 mL。充分搖勻后，4℃冰箱內靜置。分別在1、2、4和8 h，采用平板計數的方法測定細菌數[6]，并計算殺菌率。其計算公式為：殺菌率（%）=（對照管菌落數－試驗管菌落數）/對照管菌落數×100%。試驗重復3次。

1.2.5 數據處理

采用SPSS軟件中ANOVA程序進行數據統計學分析。

2 結果與分析

2.1 中藥復方和甲氧芐啶的體外抗菌試驗

從表1可知，甲氧芐啶對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抗菌活性較強，而中藥復方對金黃色葡萄球菌抗菌活性較強，對沙門氏菌和大腸桿菌相對較差。

表1 藥物對3種細菌的MIC值Table 1 MIC of drugs on three kinds of bacteria

2.2 中藥復方與甲氧芐啶聯用體外抗菌增效試驗

試驗結果見表2～4。從表中可知，當甲氧芐啶添加劑量為 40 μg·mL－1時，表現出顯著的抗菌增效作用（P＜0.01），且隨著劑量的升高而增強。但甲氧芐啶的添加劑量為160與320 μg·mL－1兩組比較差異性不顯著（P＞0.05），表明甲氧芐啶的添加劑量與其對中藥復方抗菌增效作用之間的存在一定的線性關系，并不是TMP的添加劑量越大越好，而是存在一個最優的添加劑量。此外，還發現甲氧芐啶與中藥復方聯用的最佳添加量依據菌種的不同也存在較大的差異。利用最小二乘法對各表的1、2、4和8 h殺菌率進行擬合，均符合一元二次方程y=ax2+bx+c，擬合度均達到0.95以上；然后依據公式ymax=－b/2a計算甲氧芐啶添加的最優值。計算出對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌甲氧芐啶添加的平均最優值分別為224、244和252 μg·mL－1。將甲氧芐啶添加的平均值與中藥復方用量（金黃色葡萄球菌為78 mg·mL－1，大腸桿菌和沙門氏菌為156 mg·mL－1）進行換算，得到甲氧芐啶對中藥復方體外抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌最優添加劑量分別為2.9、1.6和1.6 mg·g－1。

表2 藥物聯用對金黃色葡萄球菌的殺菌率(±S,%)Table 2 Bactericidal rate of drugs combination against Staphylococcus aureus（μg·mL-1）

表2 藥物聯用對金黃色葡萄球菌的殺菌率(±S,%)Table 2 Bactericidal rate of drugs combination against Staphylococcus aureus（μg·mL-1）

注：同行間比較，不同字母間相比較差異顯著（P＜0.05），含相同字母者為差異不顯著（P＞0.05）；下同。Note:Comparison between the same line,different letters mean significant difference(P＜0.05)，same letter means insignificant difference(P＞0.05).The same as below.

時間（h）Time甲氧芐啶添加量Trimethoprim dosage 0 204080160320 45.06±1.24a 56.45±1.55a 65.88±2.15a 80.94±1.32a 1 2 4 8 48.88±1.56ba 59.93±1.64ba 68.68±2.00a 82.14±2.66ba 51.31±2.28b 63.08±2.60bc 74.88±1.52b 85.77±2.32b 56.02±1.59c 67.66±2.05cd 80.43±3.07c 90.16±2.05c 59.39±0.83cd 70.24±2.26d 84.06±3.74cd 92.98±2.52c 62.43±1.22d 71.28±2.14d 85.95±2.16d 93.30±1.59c

表3 藥物聯用對大腸桿菌的殺菌率(±S,%)Table 3 Bactericidal rate of drugs combination against Escherichia coli（μg·mL-1）

表3 藥物聯用對大腸桿菌的殺菌率(±S,%)Table 3 Bactericidal rate of drugs combination against Escherichia coli（μg·mL-1）

時間（h）Time甲氧芐啶添加量Trimethoprim dosage 0 204080160320 37.75±1.56a 51.54±0.80a 62.29±1.55a 74.10±1.19a 1 2 4 8 41.91±1.69a 53.86±1.61a 65.85±2.39a 76.22±1.86a 46.06±1.45b 60.01±1.50b 70.58±2.89b 81.04±1.55b 52.86±0.89c 65.95±1.59c 76.38±1.97c 85.81±1.13b 56.98±1.59cd 70.80±1.23d 82.92±1.41d 90.70±1.44c 59.19±1.22d 71.57±0.83d 85.04±1.47d 94.06±0.90c

表4 藥物聯用對沙門氏菌的殺菌率Table 4 Bactericidal rate of drug combination against Salmonella (X±S,%)

3 討論與結論

中藥復方中黃芩為君藥，以連翹、蒲公英為臣藥，板藍根清熱解毒，與黃芩、連翹相呼應，共湊清熱解毒、消腫散結之功效。試驗結果表明,中藥復方對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的MIC值分別為78、156和156 mg·mL－1。而張丁華等自擬6種中藥復方對沙門氏菌的MIC為41.7～166.7 mg·mL－1，對大腸桿菌的 MIC 在 62.5～125 mg·mL－1之間[7]。盧芳國等報道 12種中藥復方對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均在62.5～125 mg·mL－1之間[8]。抗菌活性的差異一方面是與中藥復方的組成有關，另外也與細菌的毒力、接菌數量和試驗方法等密切相關。

甲氧芐啶對中藥增效作用的報道多是定性研究[9－10]，而甲氧芐啶與中藥聯用時的最佳添加劑量的研究更具有臨床實際應用價值。本試驗依據甲氧芐啶MIC值，設定了甲氧芐啶的系列添加劑量；采用了4℃靜置的方式使藥物作用于細菌，避免了37℃恒溫培養時細菌呈幾何基數增殖造成的用藥組與對照組之間的不可比性；再利用最小二乘法對試驗數據進行處理，從而提高了試驗結果的準確性。結果表明甲氧芐啶對中藥復方發揮了明顯的抗菌增效作用，并計算出甲氧芐啶對中藥復方體外抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌最優添加劑量，由于中藥的體外抗菌機制尚未明確，所以二者聯用增效的機理有待于進一步探討。

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