家蠶核型多角體病毒orf79克隆及原核表達

郝碧芳，徐 昉 ，王 猛 ，沈興家

（1.江蘇科技大學蠶業研究所，江蘇 鎮江 212018；2.江蘇科技大學生物與化學工程學院，江蘇 鎮江 212018）

家蠶核多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）隸屬于桿狀病毒科核多角體病毒屬，是專一寄生于家蠶的一種重要病原微生物，每年都給蠶業生產帶來巨大損失。同其他桿狀病毒一樣，BmNPV的感染循環過程具有雙向復制周期，產生兩種病毒形式，一種為出芽型的病毒粒子（Budded virus,BV），介導病毒的水平傳播，另一種是包涵體型病毒（Occlusion-derived virus,ODV），介導病毒的垂直傳播[1]。ODV是桿狀病毒在昆蟲宿主之間傳播所必需的，當家蠶吞下污染包涵體的飼料，包涵體在中腸堿性環境下裂解釋放出ODV，病毒粒子穿過圍食膜后與中腸上皮細胞微絨毛結合，以直接的膜融合方式侵入中腸上皮細胞[2]，釋放出核衣殼，核衣殼被運送到中腸細胞的細胞核內開始復制、組裝，在昆蟲敏感組織中重復這一復制過程并產生ODV以及多角體，導致昆蟲死亡。

桿狀病毒的ODV與宿主中腸上皮細胞的融合是病毒入侵宿主的關鍵，迄今為止已經發現6種定位于ODV膜上的口服感染因子（Peros infectivityfactors，PIFs），它們是病毒在宿主中腸起始初次感染時必需的[3-5]。p74是最早被鑒定的口服感染因子，也被稱為PIF0，PIF1，PIF2，PIF3，PIF4與ODV e-56也先后被證明是口服感染必需因子。其中 PIF-4（Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV ORF96）是Fang等在2009年發現了一個新的口服感染因子[6]，缺失了PIF-4的缺陷病毒在體外不影響BV的感染性以及DNA的復制，其感染性和野生病毒沒有區別，但是口服感染測定顯示其對幼蟲沒有感染性。BmNPV orf79是pif-4的同源基因，雖然T3株的序列已經報道，但其具體功能尚不清楚，而BmNPV口服感染因子的研究是開展家蠶病毒病防止的前提條件；目前的研究表明桿狀病毒感染宿主是通過感染復合體來完成的[7]，但是BmNPV的相關研究尚未報道，所以利用pull-down技術，以可溶性的病毒蛋白開展與宿主因子以及病毒其他因子的互作研究具有重要意義。

本研究從BmBacJS13[8]中克隆并測定orf79基因序列，對其進行生物信息學分析，利用原核表達系統開展ORF79的表達條件的探索，并利用親和層析技術獲得純化的蛋白，為深入開展orf79在BmNPV感染中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

BmBacJS13、DH10B、BL21菌株由本所重點實驗室保存，Pyrobest聚合酶為TaKaRa產品，IPTG、堿性磷酸酶標記的羊抗兔的IgG、還原型谷胱甘肽購自Promega公司，引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成，Sepharose 4B GST親和材料以及其他常規試劑購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 Orf79基因的PCR擴增及序列分析

根據BmNPV T3株（L33180）orf79基因的序列，設計引物：79F（5'GGCATGTTGTCAATCA TTTTGGCTAT3'）、A79R（5'GCGCTCGAGTTAATA AACTTGGTCTGTAGATGA 3'，下劃線示Xho I酶切位點），以BmBacJS13 DNA為模板，PCR擴增基因片段。將該基因片段克隆至原核表達載體pMD18，并進行測序。在NCBI的中進行同源序列搜索，利用www.proteinprediction.com進行二級結構預測分析，并用ClustalX對桿狀病毒同源基因進行序列分析，MEGA3.0進行進化分析，采用NJ法構建系統進化樹。

1.2.2 原核表達載體構建及融合蛋白誘導表達

利用缺失0rf79 N端跨膜域（22氨基酸）的引物A79F（5'GGCGGATCCAAAAATCACCATCCATTTT TAC 3'，下劃線示BamHⅠ酶切位點）與A79R擴增orf79，克隆至pGEX-6p-1表達載體。雙酶切鑒定pGEX-6p-79陽性克隆子，并將其轉化入大腸桿菌BL21中，挑取陽性單菌落接種于3 mL LB培養基中，37°C震蕩培養過夜。取過夜培養物按照1：100比例接種于5 mL新鮮LB培養基中，14°C震蕩培養至OD600nm為0.6，分別以不同終濃度IPTG誘導（濃度分別為：0.4、0.2、0.1和 0.05 mmol·L-1），14°C繼續培養，篩選最優誘導濃度。以選擇的最優IPTG濃度誘導，分別在誘導后1、2和4 h取1 mL培養物，離心收集菌體，重懸于500 μL PBS緩沖液中，超聲波破碎，12 000 r·min-1離心，上清用于SDS-PAGE分析。

1.2.3 融合蛋白的純化及Western blot檢測

取過夜培養菌液按照1∶100轉接500 mL培養基中，IPTG誘導2 h后5 000 r·min-1離心15 min收集菌體，PBS洗滌菌體3遍，每10 mL原培養液菌體洗滌后重懸于1 mL PBS中，超聲波破碎菌體至不再黏稠。超聲裂解液經12 000 r·min-1離心15 min，取上清用于親和層析。將上清緩緩加入到含有4 mL Sepharose 4B的純化柱中，流速為1 mL·min-1，待所有上清結合完后，用PBS（4°C，pH 7.4）清洗純化柱（10 mL×5次），然后用還原型谷胱甘肽（10 mmol·L-1,pH 8.0）4 mL孵育10 min再洗脫，洗脫液用于SDS-PAGE分析。

將蛋白樣品進行12%SDS-PAGE。電泳完畢后，將蛋白轉移至PVDF膜上。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中4°C封閉過夜，TBS-T緩沖液（50 mmol·L-1Tris-Cl,200 mmol·L-1NaCl,0.1%Tween 20,pH 7.5）室溫洗膜10 min。GST多克隆抗體用0.5%脫脂牛奶稀釋2 000倍，將膜浸入抗體稀釋液中，37°C溫育1 h。TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min。二抗為堿性磷酸酶標記的羊抗兔的IgG，用0.5%脫脂牛奶稀釋5 000倍，將膜浸入二抗中，37°C溫育1 h，TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min，用NBT與BCIP顯色。

2 結果與分析

2.1 Orf79序列分析

測序結果表明BmNPV陜西株的orf79與已報道的T3株完全相同，在組I NPV、組II NPV以及GV中都是保守的一個基因，N端以及C端各有一個跨膜域結構，其中N端序列具有一定的多態性，而中間序列以及C端序列高度保守，所以推測其中間高度保守的序列可能是其功能域。如圖1所示，從進化樹可以看出，BmNPV與組I其他病毒同源性很高，但是ORF79在C端跨膜域后部多出2個β-sheet結構的序列；orf79雖然與GV同源性最低，但是關鍵的功能域序列及C端跨膜域則是非常保守的，從而表明orf79功能的保守性。

圖1 部分桿狀病毒orf79同源序列的進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysisof Baculovirus homologous gene of orf79

2.2 orf79基因的PCR擴增及原核表達載體鑒定.

結果見圖2。

圖2 Orf79基因原核表達載體Bam H I和Xho I酶切鑒定Fig.2 Determination of procaryotic expression vector by Bam H I and Xho I

由圖2可知，將擴增的orf79基因用雙酶切處理后連接到pGEX-6p-1載體上，經PCR（圖略）和酶切鑒定均正確，大小約為500 bp左右，測序結果顯示與GenBank中的orf79蛋白基因序列完全相同。

2.3 融合蛋白的優化表達

利用4種濃度的IPTG誘導BL21中pGEX-6p-79的表達4 h，收集菌液并用超聲波破碎，離心后取上清直接用于SDS-PAGE分析。結果發現有一條過量表達蛋白帶，大小為44 ku，與預測大小一致，所以GST-ORF79融合蛋白被正確表達。通過不同IPTG濃度表達量比較發現隨著IPTG濃度降低，蛋白表達量增加，但過低的濃度也不利于蛋白表達，見圖3 A；而表達時間的優化研究發現用0.1 mmol·L-1IPTG誘導表達的蛋白量差異不是很大，其中以誘導后2 h的重組蛋白表達量最大，結果見圖3B。

2.4 融合蛋白的純化與Western blotting檢測

將500 mL超聲處理的菌液上清經Glutathione Sepharose 4B純化，收集洗脫液進行SDS-PAGE分析，結果顯示純化后得到一條純蛋白帶，其分子質量大小約為44 ku左右，與預期大小一致，如圖4所示。利用Western-blotting對純化的蛋白進行檢測，能夠檢測到目的條帶，結果表明GST-ORF79正確表達。

圖3 融合蛋白表達條件優化分析Fig.3 Optimization of expressing condition of fusion protein

圖4 純化的融合蛋白SDS-PAGE以及Western blotting檢測Fig.4 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the purified fusion protein

3 討論與結論

口服感染因子是桿狀病毒感染宿主昆蟲的必需因子，所以在桿狀病毒中都能發現orf79的同源基因，同時不同屬的病毒間又有一定的差異性，但是其中比較保守的功能域則同源性非常高。我們的分析結果表明顆粒體病毒屬（GV）與BmNPV orf79的差異較大，其原因可能是病毒在與宿主的共進化過程中為適應不同的宿主發生相應的變異。在病毒蛋白的原核表達過程中，我們發現不同的誘導條件對BmNPV的ORF79重組蛋白表達有顯著影響，37℃條件誘導的重組蛋白多以包涵體的形式存在（圖略），而在14℃條件誘導，多以可溶形式存在，誘導的IPTG濃度及誘導表達時間也是主要的影響條件，本研究針對各影響因素對誘導條件進行了優化，獲得了最優的誘導條件。在優化的誘導條件下，IPTG濃度0.1 mmol·L-1，誘導時間2 h達到峰值，這與郭慶勛以及華秋東等的探索條件有所不同，這可能與所表達的蛋白特性有一定關系[9-10]。本研究通過親和層析方法成功從裂解液上清中純化出重組融合蛋白，為下一步利用pull-down技術開展可溶蛋白與宿主中腸上皮細胞的互作研究以及病毒感染復合體的探索研究打下基礎。

[1] Funk C J,Braunagel S C,Rohrmann G F.Baculovirus structure.The baculoviruses[M].New York:Plenum Press,1997:7-32.

[2] Granados R R,Lawler K A.In vivo pathway of Autographacalifornica nuclear baculovirus invasion and infection[J].Virology,1981,108(2):297-308.

[3] Yao L,Zhou W,Xu H,et al.The Heliothis armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirusenvelope protein P74 is required for infection of the host midgut[J].Virus Res,2004,104(2):111-21.

[4] Ohkawa T,Washburn J O,Sitapara R,et al Specific binding of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to midgut cells of Heliothis virescens larvae is mediated by products of pif genes Ac119 and Ac022 but not by Ac115[J].J Virol,2005,79(24):15258-64.

[5] Haas-Stapleton E J,Washburn J O,Volkman L E.P74 mediates specific binding of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothis virescens Larvae[J].J Virol,2004,78(13):6786-91.

[6] Fang M,Nie Y,Erlandson M A,et al.Autographa californica M nucleopolyhedrovirus core gene ac96 encodes a per os infection factor(pif-4)[J].J.Virol,2009,83(23):12569-78.

[7] Peng K,van Oers M M,Hu Z,et al.Baculovirus per os infectivity factors form a complex on the surface of occlusion-derived virus[J].J Virol,2010,84(18):9497-504.

[8] Huang J,Hao B,Deng F,et al.Construction of the Bac-to-Bac system ofBombyx morinucleopolyhedrovirus[J].Virologica Sinica,2007,22(3):218-25.

[9] 郭慶勛,阮文淵,懷鳳濤,等.辣椒素生物合成途徑基因pal克隆及原核表達分析[J].東北農業大學學報,2010,41(5):66-71.

[10] 華秋東,姜成剛,王海,等.人/猴免疫缺陷病毒SHIV衣殼蛋白p27的表達純化及活性鑒定[J].東北農業大學學報,2008,39(11):51-55.