大鱗副泥鰍(2n♀)×泥鰍(4n♂)雜種后代染色體帶型及FISH分析

賈光風，李雅娟，錢 聰，高 敏

（1.大連市甘井子區農林水利和海洋漁業局中國海監甘井子區大隊，遼寧 大連 116033；2.大連海洋大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116023）

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）和大鱗副泥鰍（Pararnisgurn dabryanus）是我國常見的小型經濟魚類。近幾年來，隨著市場經濟的發展和出口量的不斷增加，再加上自然水域環境受到人為的破壞，生產量逐年下降，很難滿足市場的需求。目前養殖規模逐年擴大，已經成為目前主要的養殖品種。因此，良種的選育就顯得十分重要。人工誘導三倍體魚類以其育性差、生長快等特性而成為魚類遺傳育種研究的熱點。但人工誘導三倍體等方法存在產量低、不穩定和難操作的特點，無法滿足產業化的要求。四倍體被認為是三倍體產業化發展的關鍵，因為利用四倍體與二倍體雜交理論上可以產生100%的三倍體。目前，有關大鱗副泥鰍和泥鰍雜交的受精細胞學、染色體變化及遺傳分析已有報道[1-3]，但關于雜交后代分子細胞遺傳學方面的研究未見報道。因此，本文通過對二倍體大鱗副泥鰍和四倍體泥鰍的雜交后代的染色體進行Ag-NORs、CMA3/DA/DAPI及FISH等系列分析，旨在為雜交后代提供直接的三倍體細胞遺傳學證據，也為大規模生產全三倍體泥鰍提供有效途徑。

1 材料和方法

1.1 親魚的采集

泥鰍（4n）來自湖北省洪湖市,大鱗副泥鰍和泥鰍（2n）來自大連農貿市場。其倍性經血紅細胞核體積測量、流式細胞儀檢測確定。實驗室水族箱暫養，暫養溫度為（25±1）℃。

1.2 人工催產及授精

挑選性腺發育良好的泥鰍（2n和4n）和大鱗副泥鰍（2n）注射絨毛膜促性腺激素（HCG）（注射劑量：♀20-25 IU·g-1，♂減半），12 h后輕壓大鱗副泥鰍（2n）及泥鰍（2n）腹部即有卵排出，分別收集于不同的9 cm培養皿中，泥鰍（2n、4n）按生殖孔下邊兩側，用毛細管分別收集精液于塑料離心管中（用淡水生理鹽水稀釋100倍），干法授精。試驗分為2組，即雜交組大鱗副泥鰍×泥鰍（2n×4n）和對照組泥鰍×泥鰍（2n×2n）。應該有大鱗副泥鰍（2n×2n）與泥鰍（4n×4n）作為雙對照，否則和以證明三倍體的帶型介于二倍體和四倍體之間。

1.3 幼魚培育

孵化和幼魚培育的溫度為（25±1）℃。經常更換曝氣的水，保持室內空氣新鮮和流通。及時用吸管吸出死亡的胚胎。

1.4 染色體標本制備

取發育眼胞期的胚胎30～50個，用鑷子去卵膜和卵黃放入盛有0.0025%的秋水仙素中處理45 min，0.8%的檸檬酸低滲20 min，卡諾固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，冷凍過夜。冷滴片，鏡檢。-80℃冰箱冷凍保存。

1.5 銀染（Ag-NOR）

參照Howell and Black的快速銀染法進行[4]。50%硝酸銀與2%明膠（內含1%甲酸）以2∶1混勻后滴在染色體標本上，加蓋片后，于70℃溫箱內處理2 min。當整張玻片呈棕黃色時取出，流水沖去蓋片，干燥后鏡檢。

1.6 CMA3/DA/DAPI三重熒光染色

參照Schweizer和Schweizer的方法[5-6]，略有改動。0.5 mg·mL-1Chromomycin A3（CMA3）染色 40 min，MacIlvaine buffer（MI，pH 7）漂洗 2 次，0.1 mg·mL-1Distamycin A（DA）染色15 min，MI緩沖液漂洗 2 次，0.5 μg·mL-14,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色15 min,MI緩沖液漂洗2次,甘油和MI緩沖液1∶1封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 染色體熒光原位雜交（FISH）

本試驗采用Fujiwara的熒光原位雜交（FISH）技術方法并稍加修改[7]。

從-80℃冰箱中取出染色體標本，放入65℃恒溫箱干燥2 h。染色體標本放入70℃的70%甲酰胺/2XSSC（pH 7.0）溶液中處理2 min，迅速移入-20℃預冷的裝有70%酒精的染色缸內脫水10 min，再移入100%的-20℃預冷酒精內脫水5 min，空氣干燥。把人的5.8S+28SrDNA探針用生物素（Biotin-11-dUTP）進行標記。標記后的探針用酒精進行純化，100%脫離子甲酰胺溶解，75℃處理10 min，迅速移到冰水中。變性后的探針加入雜交混合液中，混勻后取40 μL滴到變性后的染色體標本上，覆上封口膜后放入37℃恒溫箱中雜交一個晚上。輕輕揭掉封口膜，染色體標本放入500%甲酰胺/2×SSC溶液42℃漂洗20 min，2×SSC室溫漂洗20 min，1×SSC室溫漂洗20 min，4×SSC室溫漂洗5 min。加入100 μL 10 μg·mL-1的avidin-FITC，蓋上封口膜，放在2×SSC濕盒中，37℃培養箱避光溫育1 h。輕輕揭掉封口膜，放在Triton/4×SSC溶液中避光漂洗20 min，4×SSC溶液避光漂洗5min，新的4×SSC溶液避光漂洗5 min。在有染色體范 圍 內 滴 入 100 μL 10 μg·mL-1的 biotin/antiavidin，蓋上新的封口膜，放在2×SSC濕盒中，37℃培養箱避光溫育1 h，漂洗同上。滴入50 μL 2.5 μg·mL-1的DAPI/antifade溶液，用指甲油封片，平放在載玻片夾中冷藏。用Olympus AH2熒光顯微鏡觀察雜交信號，Spot Cooled CCD裝置捕獲圖像,利用Spot和Photoshop軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 Ag-NORs

在對照組2n×2n雜交后代間期核中最高銀染點數為2個（見彩版Ⅰ-A），雜交組2n×4n雜種后代間期核中最高銀染點數為3個（見彩版1-B）；對照組2n×2n雜交后代有絲分裂中期分裂相中最高銀染點數為2個（見彩版Ⅱ-A），雜交組2n×4n雜種后代有絲分裂中期分裂相中最高銀染點數為3個（見彩版Ⅱ-B）。由此我們認為二倍體大鱗副泥鰍與四倍體泥鰍雜交產生的后代具有3個NORs，即為三倍體。

2.2 CMA3/DA/DAPI三重熒光染色

對照組2n×2n和雜交組2n×4n雜種后代中期染色體CMA3/DA/DAPI研究結果如彩版Ⅲ所示。當用B激發（藍光λ＝440～480 nm），對照組2n×2n雜交后代有絲分裂中期分裂相中，2個中部著絲粒染色體（M）的端部區域顯示有明亮的CMA3陽性部位（見彩版Ⅲ-A）；雜交組2n×4n雜種后代有絲分裂中期分裂相中，3個中部著絲粒染色體（M）的端部區域顯示有明亮的CMA3陽性部位（見彩版Ⅲ-B）。該結果與Ag-NORs位置相同，為核仁組織區（NORs）。

2.3 5.8S+28SrDNA的染色體定位

用生物素標記的5.8S+28SrDNA分別與對照組2n×2n和雜交組2n×4n雜交后代的有絲分裂中期染色體進行原位雜交。如彩版Ⅳ所示，5.8S+28SrDNA基因的熒光原位雜交結果顯示在對照組2n×2n雜交后代有絲分裂中期分裂相中兩個主要的熒光信號清晰地定位于中部著絲粒染色體短臂的端部區域（見彩版Ⅳ-A），雜交組2n×4n雜交后代有絲分裂中期分裂相中三個主要的熒光信號清晰地定位于中部著絲粒染色體短臂的端部區域（見彩版Ⅳ-B）。該結果與上述銀染及CMA3位置相同，表明二倍體大鱗副泥鰍與四倍體泥鰍雜交后代是三倍體。

3 討論與結論

硝酸銀特異地染色NORs結合的酸性蛋白,使該區域呈黑色。Ag2NORs法被廣泛地應用于魚類染色體研究中，獲得了可靠的結果，并以此作為研究物種間的親緣關系和染色體進化的一個指標[8]。Ag-NORs可以準確顯示染色體上rDNA的位置，這已為原位分子雜交所證實[9-10]。本試驗對早期胚胎間期核進行Ag-NORs染色，結果表明，在2n×2n胚胎細胞核中最高銀染點數為2個，2n×4n胚胎中細胞核中最高銀染點數為3個。在多倍體魚類的倍性鑒定中，銀染核仁組織區法與其他多倍體魚類的倍性檢測方法相比，不但快捷準確而且省時省力，無需特殊的儀器，在條件相當簡陋的實驗室就可以進行操作，是值得推廣的一種好方法。

CMA3與DAPI均為熒光染料，CMA3染色可以特異性地顯示一些生物的核仁組織區（NORs）及其他某些GC豐富區，DAPI則于染色體上的AT富含區專一性結合。因而，只要存在NORs就可用CMA3染色顯示出來。CMA3染色強度與NORs處的GC含量呈正相關[8]。目前為止,CMA3染色研究以見于植物、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類等多種生物，在所有這些生物類群中，NORs呈現明顯的熒光（CMA3陽性）。因此，CMA3染色為生物NORs的識別鑒定提供了另一快速、簡便的手段[11]。本研究結果表明，2n×2n雜交后代有絲分裂中期分裂相中，中部著絲粒染色體（M）的端部區域顯示有2個明亮的CMA3陽性部位；2n×4n雜交后代有絲分裂中期分裂相中，中部著絲粒染色體（M）的端部區域顯示有3個明亮的CMA3陽性部位。與Ag-NORs位置相同，說明2n×4n雜交后代具有3套染色體組，是三倍體。

rDNA為高度串接重復序列，其編碼區的保守性和非編碼區的多態性是研究動植物系統發育與進化的一個有用標記[12]。rDNA在染色體上分布的數目和具體定位可作為標記來識別染色體以及分析多倍體物種的進化過程[13]，同時rDNA在染色體上的定位可以對傳統核型的分析進行校正，尤其對于染色體較小且形態特征不明顯的材料，可以提高同源染色體配對的準確性。本研究將人的5.8S+28SrDNA清晰地定位于二倍體大鱗副泥鰍和四倍體泥鰍雜交后代的染色體上。2n×2n中兩個主要的熒光信號清晰地定位于中部著絲粒染色體短臂的端部區域，2n×4n中三個主要的熒光信號清晰地定位于中部著絲粒染色體短臂的端部區域。

Sola以18SrDNA為探針對杜氏鰤魚（Seriola dumerili）進行了FISH分析[14]，得到的結果與通過銀染和CMA3染色得到的NORs位點相吻合,而且NORs所有的順反子（Cistrons）都是有活性的。Rossi分別對鯔（Mugil cwphalus）和薄唇梭（Liza ramada）做了類似的研究[15-16]，也得到了類似的結果。Li以人的5.8+18SrDNA為探針對二倍體和四倍體泥鰍進行了FISH分析[17]，得到的結果與通過銀染和CMA3染色得到的NORs位點相吻合。但是Pendas在對鮭（Salmosalar）的研究中卻發現Ag-NORs位點與FISH信號并不完全重疊[18]，他們的結果表明，鮭的Ag-NORs位點只局限在次縊痕位置，而FISH信號卻散布在NORs所在的整個染色體臂上。本研究Ag-NORs、CMA3/DA/DAPI及5.8S+28S rDNA的FISH定位在2n×4n雜交后代染色體上的位置相同，均位于中部著絲粒染色體（M）的端部區域，即核仁組織區域（NORs）。該結果為雜交后代提供了直接的三倍體細胞遺傳學證據，也為大規模生產全三倍體泥鰍提供有效途徑。

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