小鼠乳腺組織不同發育時期STAT1和PIAS1蛋白表達

李 曄，李慶章

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，哈爾濱 150030）

STATs蛋白家族是一類反式作用因子，它既參與細胞跨膜信息向核內的傳輸，又直接參與靶基因的轉錄調控，廣泛參與細胞增殖、分化、周期調控及凋亡過程[1]。STAT1是STATs家族中最先發現的成員，可被INFα、INFY、IL－6、FGF、GM－CSF和PDGF等細胞因子激活[2]。它不僅在機體免疫應答、炎癥反應等多種生理、病理過程中發揮重要作用，還控制著大量基因的轉錄，涉及到細胞的生長分化、凋亡的調節、細胞因子產生等。

PIAS1是Shuai等用酵母雙雜交篩選能與STAT1的C端轉錄活性功能區作用的蛋白質時發現的[3]，是STAT1特異性抑制子，同時也是PIASs蛋白家族的第一個成員。其對STAT1的抑制作用，一方面是通過與二聚化的STAT1結合、掩蓋STAT1的DNA結合功能域，從而抑制轉錄[4]；另一方面是通過與STAT1單體結合阻礙其二聚化而實現。近期研究表明，PIAS蛋白不只是激活STATS的抑制蛋白，它們還與許多其他蛋白質相互作用，參與多種轉錄因子的活性調控和多種蛋白質修飾，從而調控細胞的增殖、分化及細胞凋亡等，與腫瘤性疾病密切相關[5]。PIAS1－/－小鼠表現為STAT1介導的部分基因轉錄增加，對病毒和細菌的抵抗力增強，對脂多糖引起的內毒素性休克敏感，血清中促炎癥反應因子水平增高，發育遲緩，圍產期死亡等[6]。目前為止還沒有對正常乳腺組織中STAT1及PIAS1在蛋白水平表達進行系統檢測的報道，也沒有關于STAT1及PIAS1在小鼠乳腺發育和泌乳中具體作用的系統研究。本研究旨在闡述STAT1及PIAS1在哺乳動物乳腺發育、泌乳及退化過程中表達定位的動態變化，揭示STAT1及PIAS1表達變化與乳腺發育及泌乳功能的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組與取材

實驗動物為BALB/c小鼠。根據小鼠乳腺發育的時間和生理特點，分別在青春期（V）、妊娠期（P）、泌乳期（L）以及退化期（I）（在泌乳22 d時將母鼠與子鼠分籠，分籠后第1日記為自然退化1 d），4個時期共設立12個取樣點（青春期4周V4w，青春期5周（V5w），青春期7周（V7w），妊娠期2 d（P2 d），妊娠期9 d（P9 d），妊娠期13 d（P13 d），泌乳期2 d（L2 d），泌乳期9 d（L9 d），泌乳期13 d（L13 d），退化期2 d（I2 d），退化期5 d（I5 d），退化期10 d（I10 d），每個取樣點選取3只小鼠作平行，每次試驗至少重復3次。斷頸處死，分離剪取第4對腺體，液氮速凍3 min，轉移至－80℃低溫冰箱保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

Trizol（Invitrogen）， SYBR PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa），羊抗鼠PIAS1多克隆IgG（sc－8152），兔抗鼠STAT1多克隆IgG（sc－346），β－Actin小鼠單克隆IgG（sc－47778），辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，驢抗羊IgG－FITC（sc－2024），驢抗兔 IgG－R（sc－2095）（以上均為 Santa Cruz Biotechnology）。DAPI，Triton－X－100。其他試劑均為市售分析純試劑。7300 PCR擴增儀（美國Applied Biosystem）、激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica TCS SP2）、蛋白電泳儀、半干轉移電泳儀（美國Bio－RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的熒光定量PCR分析

應用熒光定量PCR方法檢測青春期、妊娠期、泌乳期和退化期小鼠乳腺組織中STAT1和PIAS1基因mRNA表達水平變化。試驗中選用β－actin這一在不同組織中穩定表達的基因作為內參，各基因表達的檢測結果通過計算可獲得相對表達量，各基因的引物如表1所示。

RNA經過反轉錄后使用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行熒光定量PCR試驗，試驗儀器為ABI公司的7300熒光定量PCR儀。反應條件為：預變性95℃ 10 s；95℃5 s，60℃31 s，40個循環；溶解曲線分析。每個基因進行3個平行試驗。

表1 相關基因qRT-PCR引物設計Table 1 Primer of genes for qRT-PCR

1.2.2 小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的Western blotting表達定量分析

分別取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期小鼠乳腺組織提取總蛋白，選擇5%的濃縮膠和10%的分離膠進行SDS－PAGE分析。電泳結束后將凝膠上的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，37℃用脫脂牛奶封閉2 h，用3 mL 1∶500稀釋的抗體4℃孵育過夜。取出后用TBST洗3次，每次5 min，再用3 mL 1:2 000稀釋的相應IgG二抗37℃搖床孵育1 h，TBST洗3次，發光液顯色，在暗室中曝光、顯影。使用BandScand 4.3軟件對圖像進行灰度掃描，記錄灰度值。

1.2.3 小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的免疫熒光表達定位檢測

分別取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期小鼠乳腺組織制作冰凍切片，4%多聚甲醛室溫固定10 min后用PBS洗3次，每次10 min，10%BSA 37℃孵育90 min，STAT1和PIAS1混合抗體4℃孵育過夜（抗體用0.4%TritonX－100/PBS稀釋，稀釋比例1∶100）。取出后用PBS洗3次，每次5 min，用驢抗羊IgG－FITC和驢抗兔IgG－R二抗混合物，37℃孵育30 min（稀釋比例1∶200），PBS洗3次，每次10 min，DAPI染核5 min，PBS洗2次后，用抗熒光淬滅封片劑封片。每只小鼠的乳腺取不同部位進行連續切片，每個試驗至少重復3次，每張切片選取3個視野觀察，用激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscopy，LSCM）進行掃描拍照（400×）。

1.3 數據處理

應用SPSS16.0統計分析軟件進行數據統計分析，所得數據均以平均數±標準差表示，同一樣本不同處理的結果進行t檢驗，多組數據之間進行方差分析（P＜0.05），為統計學有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的熒光定量PCR分析

不同時期小鼠乳腺組織樣品提取總RNA，應用qRT－PCR方法，以β－actin為內參，分別擴增STAT1、PIAS1及內參基因β－actin，得出表達結果。STAT1在小鼠乳腺不同發育時期表達的變化趨勢：STAT1在青春期隨著乳腺組織的發育表達量有所增加，但相對較低（P＜0.05）；妊娠期表達量最低且顯著低于其他時期（P＜0.05）；而在泌乳期初期出現相對較高峰值，隨后降低至妊娠期水平、退化期表達相對逐漸升高，在退化末期達到峰值，且差異顯著（P＜0.05）（見圖1）。PIAS1在小鼠乳腺不同發育時期表達的變化趨勢：PIAS1在青春期表達相對較低（P＜0.05），妊娠初期表達量相對青春期有

圖1 小鼠乳腺發育、泌乳及退化過程中STAT1 mRNA表達動態變化Fig.1 Expression of STAT1 mRNA in mouse mammary gland development,lactation and involution

2.2 小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的Western blotting表達定量分析

不同時期小鼠乳腺組織樣品提取總蛋白，以β－actin為內參，分別檢測STAT1、PIAS1及內參基因。STAT1在小鼠乳腺不同發育時期表達的變化趨勢：STAT1在青春期隨著乳腺組織的發育表達量有所增加；妊娠期表達量最低且顯著低于其他時期（P＜0.05）；而在泌乳期初期相對較低，隨后隨著泌明顯升高，在泌乳期初期出現相對較高峰值且維持在泌乳時期，停止泌乳后表達量降低至妊娠期水平，在乳腺退化過程中逐漸升高在退化末期達到峰值，且差異顯著（P＜0.05）（見圖2）。乳結束、退化期表達相對逐漸升高在退化末期達到峰值，且差異顯著（P＜0.05）（見圖3，4）。PIAS1在小鼠乳腺不同發育時期表達的變化趨勢：PIAS1在青春期低表達，妊娠初期表達量相對青春期有明顯升高，在泌乳期初期出現相對較高峰值且維持在泌乳時期，停止泌乳后表達量降低至妊娠期水平，在乳腺退化過程中逐漸升高在退化末期達到峰值，且差異顯著（P＜0.05）（見圖3，4）。

圖2 小鼠乳腺發育、泌乳及退化過程中PIAS1 mRNA表達動態變化Fig.2 Expression of PIAS1 mRNA in mouse mammary gland development,lactation and involution

圖3 小鼠乳腺發育、泌乳及退化過程中STAT1和PIAS1蛋白表達變化Fig.3 Expression of STAT1 and PIAS1 in mouse mammary gland development,lactation and involution

圖4 小鼠乳腺發育、泌乳及退化過程中STAT1和PIAS1蛋白表達動態變化Fig.4 Expression of STAT1 and PIAS1 in mouse mammary gland development,lactation and involution

2.3 小鼠乳腺中STAT1及PIAS1的免疫熒光表達定位檢測

STAT1和PIAS1作為重要的轉錄因子，主要分布于導管和腺泡上皮細胞及脂肪細胞細胞質中。青春期乳腺中實質組織很少，乳腺大部分被脂肪墊占據，STAT1和PIAS1表達相對較弱，腺泡上皮細胞和導管上皮細胞有少量表達（見彩版ⅠA～C）。妊娠期乳腺上皮細胞廣泛增殖，引起乳腺腺泡結構的大量發育，脂肪細胞和乳腺腺泡上皮細胞均有STAT1和PIAS1表達，主要在乳腺腺泡和乳導管的腔壁上，PIAS1表達相對明顯（見彩版ⅠD～F）。泌乳期，腺泡上皮細胞和脂肪細胞STAT1和PIAS1表達明顯（見彩版ⅠG～I）。退化期乳腺的腺泡開始逐漸消失，乳腺腺泡和導管上皮細胞都有STAT1和PIAS1表達，而隨著退化期的進行乳腺上皮細胞PIAS1表達也較明顯（見彩版ⅠJ～L）。

3 討論

STAT1是STATs家族中最先發現的成員，可被細胞因子激活，參與機體多種生理、病理過程[7]；同時還控制著大量基因的轉錄，涉及到細胞的生長分化、凋亡的調節[8]、細胞因子產生等。STAT1是由IFNs介導的抑制生長、促進凋亡蛋白因子，研究表明STAT1缺失可導致生長抑制失調，并且可以激活轉錄因子cyclin D1的激酶抑制子p21[9－11]。PIAS蛋白最初是作為STAT信號通路的負性調節因子而確定的，PIAS1與STAT1相互作用并阻止其與DNA結合。除了STAT1，PIAS1還能與NF－κBp65亞單位相互作用，抑制其介導的轉錄。新近研究發現PIAS具有SUMO－E3連接酶活性，介導多種蛋白發生類泛素化[12－13]，PIAS1能促進SMAD4的類泛素化，正性調節TGF－β信號通路[13]；PIAS蛋白亦具有促凋亡效應，在人293T細胞系和骨肉瘤U2OS細胞系中PIAS1能夠誘導凋亡[14]；PIAS1促進Sam68類泛素化，從而抑制細胞周期蛋白cyclin D1表達及細胞凋亡[15]；PIAS1可抑制Oct4作用，影響干細胞分化影響[16]；以上提示了PIAS1蛋白重要功能。STAT1和PIAS1，作為細胞生長、分化、凋亡的調控因子，近年研究主要集中在病理狀態，據報道，乳腺組織缺少STAT1的表達可加劇癌癥風險[17]；但在正常組織中其生物學功能的研究甚少。

本研究的結果表明，青春期4周齡小鼠乳腺開始發育，STAT1和PIAS1表達水平較低，進入青春晚期后，STAT1表達略微升高，而PIAS1表達量幾乎沒有變化，青春期7周齡小鼠乳腺發育基本結束，進入性成熟階段。進入妊娠期后，STAT1的表達下降，PIAS1表達升高，在妊娠期維持相對高水平。推測PIAS1抑制STAT1的表達及行使功能。進入泌乳期后，細胞因子主要是維持細胞生存，抑制細胞凋亡；在泌乳初期STAT1和PIAS1的表達量均出現較高水平；泌乳后期，泌乳量下降，STAT1和PIAS1表達也呈下降趨勢。進入退化期STAT1和PIAS1表達水平再次升高，表明其在正常小鼠乳腺退化過程中也具有重要作用。

在小鼠乳腺發育的生理過程中，STAT1和PIAS1主要表達于乳腺上皮細胞的胞質中，表達量變化波動明顯，提示STAT1和PIAS1參與乳腺發育、泌乳及退化并通過信號轉導通路間的交互作用，并發揮一定的功能調控乳腺組織中細胞的生長和凋亡。

4 結論

小鼠乳腺整個發育各時期，STAT1和PIAS1均有表達，表達水平具有較強的相關性。青春期較低，妊娠期STAT1下降、PIAS1升高，泌乳期表達均升高并逐漸下降，退化期顯著升高，在退化末期達到最高。STAT1和PIAS1可能促進泌乳期乳腺上皮細胞的分化及泌乳發動，啟動退化期乳腺細胞凋亡和乳腺組織重建。

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