陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血液中脂肪酸組成、攝取及血液脂質指標的影響

張養東，王加啟，胡 濤，徐 俊，李珊珊，卜登攀，孫 鵬，周凌云

（1.東北農業大學動物營養研究所，哈爾濱 150030；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193）

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌崩解時釋放的一種主要成分，是誘發動物機體產生炎癥反應的主要誘因之一[1－3]，在機體發生炎癥反應的同時，機體脂類代謝也受相應的調控[4－5]。研究表明，LPS能下調鋸齒類動物的脂蛋白酯酶活性[6]；脂蛋白酯酶不僅影響脂肪酸的吸收而且在清除循環血液中甘油三酯乳糜微粒和極低密度脂蛋白膽固醇（Low－density lipoprotein cholesterol,LDLD）上起著重要作用，甘油三酯乳糜微粒和極低密度脂蛋白又是機體抵御LPS毒性的一種重要的宿主防御機制[7]。在反芻動物上，瘤胃異常發酵產生的LPS可能遷移入血，影響血液中脂類代謝[3,8]。但LPS是否是誘發脂類代謝發生變化的主要因子還未獲得充分證實。因此，本試驗在避開反芻動物特有的瘤胃反應器的基礎上，通過陰外動脈灌注LPS直觀的研究LPS對泌乳奶牛脂類代謝的影響，以期為今后的試驗提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗日糧

選用6頭經產的荷斯坦奶牛（BW=（576.33±36.67）kg,DIM=（185.67±30.11）d），隨機分成2組。以玉米、豆粕、麥麩、青貯、苜蓿干草及羊草為主要原料配制基礎日糧，日糧養分組成滿足中國農業行業標準推薦（NY/t 34,2004）的營養需求。試驗日糧的組成及營養成分如表1所示。

注：1.含有 （干物質基礎） Contains(DM),Fe 5 500 mg·kg－1,Cu 4 080 mg·kg－1,Zn 17 500 mg·kg－1,Mn 4 980 mg·kg－1,Se 110 mg·kg－1,I 180 mg·kg－1,Co 88.5 mg·kg－1,VA＞2 000 IU·g－1of vitamin A,600 IU·g－1of vitamin D3,10.8 mg·g－1of vitamin E.2.凈能值 (Mcal·kg－1)參照農業行業標準(China NY/t 34,2004)計算。Calculated net energy value according to the feeding standard of dairy cattle(China NY/t 34,2004).

1.2 試驗設計與飼養管理

試驗采用交叉試驗設計，分兩期進行，每期試驗7 d，間隔期14 d。第一期試驗前7 d（－7 d）為預飼期，奶牛接受一次陰外動脈生理鹽水（Saline）灌注，使動物機體適應灌注條件，減輕灌注對動物機體的應激。正式期3頭奶牛灌注LPS（Escherichia coli O111:B4，0.01μg·kg－1體重），另外3頭奶牛灌注Saline。在第二期試驗時，2組奶牛進行交叉。每期試驗都于試驗日7:00正式開始。

LPS用無致熱源的滅菌生理鹽水配制成0.5 mg·mL－1儲備溶液，然后用無致熱源的滅菌生理鹽水按照每kg牛體重0.01 μg LPS配制終體積10 mL溶液，對照組為10 mL無致熱源的滅菌生理鹽水。配制好的溶液經預熱達到37℃時，經右側陰外動脈一次性灌注，灌注時要盡量保持試驗動物安靜，必要時給實驗動物套上“防踢棒”，灌注緩慢而均勻進行，在5 min內灌注完畢，隨后再用10 mL無致熱源的滅菌生理鹽水沖洗灌注管道，以保證灌注液全部進入試驗動物動脈血管中。

試驗動物采用栓系式飼養，日飼喂2次（7:00和19:00），自由飲水，擠奶采用利拉伐手推式擠奶機進行。試驗期間，每天記錄采食量和產奶量，并觀測試驗動物的精神狀態。

1.3 樣品的采集與測定方法

血漿樣品的采集：于試驗正式開始時（0 h）、灌注后6、12、24 h分別利用真空采血管（血漿管）采集尾動脈和腹部靜脈血樣，血漿管4℃靜置過夜后，3 000 g、4℃離心15 min分離血漿。分離后的血漿于－20℃保存。

血漿中脂肪酸組成測定方法如下：利用正己烷與異丙醇的混合液提取牛奶上清液中的脂肪，然后對溶有脂肪的正己烷液體進行酸堿甲酯化，其具體分析方法參見文獻[9]。乳腺對動脈血漿中碳鏈長度大于16的脂肪酸攝取率計算方法參見文獻[10]。

血漿中總膽固醇（Cholesterol total,CHOL）、極低密度脂蛋白膽固醇（LDLD）和極高密度脂蛋白膽固醇（High－density lipoprotein cholesterol,HDLD）的測定采用Beckman Synchron CX5PRO分析系統，試劑盒購自英國RANDOX公司。

1.4 數據處理

所有數據以SAS（8.2）軟件MIXED模塊進行統計學檢驗。統計模型中包含試驗牛的隨機因素和試驗期、試驗處理、試驗時間以及試驗處理與試驗時間的交互效應等的固定因素。變量的統計結果均以最小二乘均數形式列表，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中脂肪酸組成的影響

由表2、圖1、圖2和圖3結果可知，陰外動脈灌注LPS未顯著影響動脈血漿中脂肪酸組成（P＞0.05），但有增加動脈血漿中TFA量和SFA含量，降低血漿中MUFA、PUFA、TUFA含量的趨勢。與對照組相比，動脈血漿中SLFA含量（P＞0.05）和CLFA含量（P＞0.05）有不同程度的提高，隨著灌注后時間的持續呈先升高后降低的趨勢；MLFA含量（P＞0.05）呈先降低后升高趨勢。

表2 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中脂肪酸組成和脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of intra-external pudic arterial administrated LPS on the milk fatty acids profile of artery plasma in dairy cows

圖1 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中SLFA的影響Fig.1 Effect of intra-external pudic arterial administrated LPS on the content of SLFA of artery plasma on dairy cows

圖2 陰外動脈灌注脂多糖對動脈血漿中MLFA的影響Fig.2 Effect of intra-external pudic arterial administrated LPS on the content of MLFA of artery plasma on dairy cows

圖3 陰外動脈灌注脂多糖對動脈血漿中CLFA的影響Fig.3 Effect of intra-external pudic arterial administrated LPS on the content of CLFA of artery plasma on dairy cows

2.2 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中碳鏈長度大于16的脂肪酸攝取率的影響

由表3結果表明，與對照組相比，陰外動脈灌注LPS提高了乳腺對動脈血液中碳鏈長度大于16的脂肪酸攝取率（P＞0.05），除C20的攝取率達到極顯著差異水平（P＜0.01）外，其他組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛血液中脂質指標的影響

由表4結果可知，與對照組相比，陰外動脈灌注LPS顯著提高了血漿中CHOL含量（P＜0.05），有提高血漿中HDLD含量和LDLD含量的趨勢，但影響差異不顯著（P＞0.05）。

表3 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛乳腺攝取脂肪酸的影響Table 3 Effect of intra-external pudic arterial administrated LPS on the milk fatty acids profile of artery plasma in dairy cows（%）

表4 陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛血液中脂質指標的影響Table 4 Effect of intra-external pudic arterial administrated LPS on the lipid indexes of artery plasma in dairy cows

3 討論與結論

3.1 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中脂肪酸組成的影響

Feingold等在鼠上研究表明，尾靜脈注射LPS提高了血液中總脂肪酸的含量（P＞0.05）[11]。本試驗結果與之相似，本試驗結果表明，與對照組相比，LPS組提高了血液中TFA量（P＞0.05）、SLFA含量（P＞0.05）和CLFA含量（P＞0.05），這可能是由于LPS降低了機體組織的脂蛋白酯酶的活力，降低了清除循環血液中甘油三酯乳糜微粒和極低密度脂蛋白（LDLD）效率[11－12]，同時提高了脂解作用所致[13－15]。

LPS在引起機體炎癥反應的同時，還導致機體產生氧化損傷[16－17]。不飽和脂肪酸由于含有烯烴鍵，具有抗氧化的機能，因此，可能是導致本試驗血液中MUFA含量（P＞0.05）、PUFA含量（P＞0.05）和TUFA含量（P＞0.05）等不飽和脂肪酸含量降低的原因，但具體機制待進一步研究。

3.2 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿中碳鏈長度大于16的脂肪酸攝取率的影響

乳汁中C4至C15以及50%的C16是乳腺內源合成的脂肪酸，乳汁中50%的C16以及C16以上的脂肪酸是乳腺直接從血漿中攝取轉運[18]。因此，本試驗計算的乳腺對脂肪酸的攝取率主要針對碳鏈長度大于16的脂肪酸。Ling和Alcorn研究結果表明，LPS影響脂肪酸結合蛋白和脂肪酸轉運蛋白mRNA的表達，泌乳鼠注射LPS下調脂肪酸結合蛋白（Fabp3）和脂肪酸轉運蛋白（Fatp4）mRNA的表達水平，但上調脂肪酸轉運蛋白（Fatp1）mRNA的表達水平[19]。本試驗結果表明，LPS不同程度的提高了乳腺中碳鏈長度大于16的脂肪酸的吸收，對碳鏈長度大于16的總脂肪酸攝取率提高了57.77%。

3.3 陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛血液中脂質指標的影響

研究表明，內毒素應激誘導機體高脂血癥[11]，產生非特異性免疫反應，引發機體重新分配營養素抵抗內毒素的毒性[20]。但在不同動物上，LPS對動物機體的脂類代謝影響不盡相同。在鋸齒類動物上，LPS提高血液中總膽固醇水平[20]和LDHD水平[11]；在靈長類動物上，LPS降低或未影響血液中總膽固醇水平和LDHD水平[20]。本試驗結果表明，陰外動脈灌注LPS提高了血液中總膽固醇、LDHD和HDHD水平，動員了機體的脂類代謝，這與血液中脂肪酸含量的提高相一致；同時，在我們的前期試驗中，LPS誘導機體發生炎癥反應（未發表），而機體脂類代謝的動員，正是機體產生非特異性免疫抵抗炎癥反應的一種機制[4,6]。

因此，當動物機體遭受LPS應激時，機體動員脂類代謝，以抵抗LPS對動物機體誘發的炎癥反應。

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