雞γ-干擾素的可溶性表達及純化產物的抗NDV活性

代 麗，單安山，孫進華，尹佳佳，李遠見

（東北農業大學動物營養研究所，哈爾濱 150030）

干擾素作為人們研究的熱點，不論是在人類臨床還是在畜牧應用和臨床獸醫中都發揮著重要的作用。IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素，它的抗病毒活性較Ⅰ型干擾素低，但它的免疫調節和疫苗佐劑效應較強[1-2]，所以又稱免疫干擾素。實踐證明：雞γ-干擾素（chIFN-γ）在抗雞球蟲作用、抗新城疫病毒、抗傳染性法氏囊病病毒和對馬立克氏病、傳染性腦脊髓炎和傳染性喉氣管炎等方面都具有較好療效，同時也能增強禽流感疫苗免疫作用[3-4]。在飼養過程中這就大大地降低了雞的死亡率，為廣大的飼養者創造出更高的經濟價值。

本研究成功擴增了雞IFN-γ成熟蛋白基因，亞克隆至原核表達載體pProEXTMHTa，在大腸桿菌BL21中誘導表達，非變性條件下進行純化并獲得了可溶性蛋白，并檢測了該蛋白的生物學活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

宿主菌：大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、表達載體pProEXTMHTa、帶有信號肽的重組質粒PMD-18T-preIFN-γ為本實驗室保存[5]；克隆載體pMD18-T載體購自TaKaRa公司；新城疫Ⅳ系弱毒苗為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

EcoRⅠ、SalⅠ、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、T4DNA Ligase、2 000 bp DNA Ladder Marker、15 000 bp DNA Ladder Marker、蛋白分子質量標準（低）、IPTG（dioxane free）、氨芐青霉素（Amp）等（均購自TaKaRa公司）；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒（購于北京天根生化科技有限公司）；硝酸纖維素膜（NC膜）（購自Amersham公司）；轉膜濾紙（購自Whatman公司）；蛋白純化試劑盒（購自Novagen公司）；鼠源抗His單克隆抗體和HRP-兔抗鼠IgG（購自中杉金橋生物技術有限公司）；細胞培養基為M199培養基。其他試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 引物

根據GenBank上已登錄的雞γ-干擾素序列(ID:X99774)及pProEXTMHTa多克隆位點，設計引物如下 ： chIFN-γ 上 游 P1： 5′GAGGAATTCATGCA TACTGCAAGTAGTCT3′（斜體下劃線處為EcoRⅠ酶 切 位 點)； chIFN-γ 下 游 P2: 5′GAGGTCGAC TTAGCAATTGCATCTCCTC3′（斜體下劃線處為SalⅠ酶切位點），用以擴增雞γ-干擾素成熟蛋白基因序列。引物由上海生工有限公司合成，預期擴增目的片段為459 bp。

1.2 ChIFN-γ基因的克隆與鑒定

1.2.1 PCR擴增chIFN-γ基因

以帶有信號肽的重組質粒PMD 18T-preIFN-γ為模板，擴增無信號肽chIFN-γ基因片段。PCR反應條件：95℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，40個循環；72℃10 min。取2 μL PCR產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ChIFN-γ cDNA克隆

將PCR產物用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉化E.coli DH5α感受態細胞，LB平板（Amp抗性）過夜培養篩選，挑選單菌落，振蕩培養后用質粒小量提取試劑盒提取質粒，PCR和雙酶切鑒定均為陽性的質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，進一步測序鑒定正確的陽性重組質粒命名為PMD 18T-chIFN-γ。

1.3 ChIFN-γ原核表達載體的構建與鑒定

Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切陽性重組質粒pMD 18-T-chIFN-γ，切出chIFN-γ目的基因，同時用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切pProEXTMHTa空載體；經DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收chIFN-γ目的基因和pProEXTMHTa空載體部分；在T4DNA Ligase作用下進行連接反應，連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，涂布含Amp的LB平板，37℃培養箱過夜，挑取單菌落，振蕩培養后用質粒小量提取試劑盒提取質粒，進行PCR鑒定及Eco RⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定，鑒定均為陽性的質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司公司測序，進一步測序鑒定正確的陽性重組質粒命名為pProEXTMHTach-IFN-γ。

1.4 rchIFN-γ的誘導表達及SDS-PAGE分析

將pProEXTMHTa-chIFN-γ轉化表達受體菌E.coli BL21（DE3），挑選單菌落接種于LB培養基（含Amp 100 μg·mL-1），37 ℃，230 r·min-1，振蕩培養過夜，次日按1%接種量接種于含10 mL新鮮LB培養基（含Amp 100 μg·mL-1）的 100 mL 錐形瓶中，30℃，230 r·min-1振蕩培養，當菌液OD600值達0.6～0.8時加入1 mmol·L-1的Isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）誘導4 h，同時取誘導前的菌液作對照。各取1.5 mL菌液于4℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀用100 μLPBS懸浮，加入100 μL的1×SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混勻100℃煮沸7～8 min，進行15%SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍染色，觀察蛋白表達結果。

1.5 Western blot分析

將表達的rchIFN-γ蛋白及空載體誘導表達菌經15%的SDS-PAGE電泳后，用半干轉印法轉印到NC膜上，5%脫脂奶封閉過夜，一抗選擇抗6His的單克隆抗體，二抗為HRP標記兔抗鼠IgG，4-CN顯色液顯色，蒸餾水終止后拍照記錄。

1.6 表達蛋白的可溶性分析及純化

將誘導4 h的菌液于4℃，4 100 r·min-1離心10 min，將沉淀懸浮于PBS溶液中，混勻，置冰浴進行超聲波破碎，設置程序為每超聲6 s，間隔6 s，功率300 W，全程6 min。裂解菌液于4℃，12 000 r·min-1離心30 min，分別取上清和沉淀進行15%的SDS-PAGE分析。然后進行純化，首先將沉淀懸浮于PBS溶液中，加入5%的甘油和終濃度為1 Mm的PMSF混勻，接著按Novagen蛋白純化試劑盒的操作指南進行天然純化，收集洗脫下來的目的蛋白，然后按照蛋白純化儀中的脫鹽程序進行脫鹽，收集蛋白液，并用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定其蛋白的濃度。

1.7 純化的rchIFN-γ蛋白生物學活性測定

利用雞成纖維細胞-新城疫（新城疫Ⅳ系弱毒苗）（CEF-NDV）系統測定天然純化的rchIFN-γ蛋白的抗病毒效價。將純化的rchIFN-γ用維持液（M199+2%FCS）依次進行5倍稀釋，稀釋6個梯度，加至已長成單層的96孔板的CEF細胞上，每孔100 μL，每個稀釋度做6個重復孔，37℃，5%CO2孵育24 h；棄上清，每孔接種100TCID50的NDV，每孔200 μL，同時設立NDV陽性對照（不加干擾素，只加NDV）、陰性對照（只加干擾素，不加NDV）和空白對照（不加干擾素，也不加NDV）。37℃培養24～48 h后在倒置顯微鏡下觀察，待陽性對照細胞出現明顯致細胞病變效應（Cytopathogenic effect，CPE）時判定結果，能抑制50%細胞病變的rchIFN-γ的最高稀釋度的倒數作為干擾素抗NDV活性單位[6]。

2 結果與分析

2.1 ChIFN-γ基因原核表達載體的構建與鑒定

重組質粒經PCR和雙酶切鑒定，均可以得到459 bp左右的目的條帶，與預期結果相符。結果見圖1。

圖1 重組pProEXTMHTa-chIFN-γPCR和酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pProEXTMHTa-chIFN-γ

2.2 核苷酸序列測定

克隆的chIFN-γ基因經上海生工生物工程技術服務有限公司測序結果如下，片段大小為459 bp，與預期大小相符。序列與1995年Digby等人首次成功克隆的chIFN-γ基因序列完全相同[7]。

2.3 表達產物SDS-PAGE鑒定

SDS-PAGE電泳結果顯示，在約20.0 ku處出現特異性目的條帶，大小與預期相符，而未誘導對照無此特異性條帶（見圖2），利用Bandscan軟件分析目的蛋白的表達量在40%左右。

2.4 Western blot分析

Westernblot結果表明，表達rchIFN-γ蛋白能與抗6His的單克隆抗體在目的帶20.0 ku處發生特異性顯色反應，而未誘導的沒有顯色反應（見圖3）。

圖2 SDS-PAGE分析雞IFN-γ在pProEXTMHTa表達系統中的表達Fig.2 SDS-PAGE analysis of chIFN-γ expressed in pProEXTMHTa system

圖3 Western blot鑒定rchIFN-γ蛋白Fig.3 Western blot analysis

2.5 表達產物可溶性分析及純化

可溶性分析表明：表達蛋白一部分在上清中以可溶的形式存在；而一部分在裂解沉淀中以包涵體的形式存在（見圖4）。

利用Bandscan軟件分析可溶性蛋白的含量占總蛋白含量的50%左右。利用Novagen公司純化試劑盒對表達產物進行純化，經SDS-PAGE電泳，結果顯示了良好的純化效果，pProEXTMHTa-IFN-γ得到了單一的目的條帶（見圖5）。

純化的重組chIFN-γ原核表達蛋白的濃度經試劑盒測定后結果為1.9mg·mL-1。

圖4 SDS-PAGE分析rchIFN-γ蛋白的可溶性Fig.4 SDS-PAGE analysis of the solubility of rchIFN-γ protein

圖5 表達產物的純化Fig.5 Purified product of expressed pProEXTMHTa-chIFN-γ protein

抗病毒活性試驗結果表明：細胞對照組生長良好（見圖6-a），純化rchIFN-γ蛋白（1∶54稀釋）能抵抗100TCID50的病毒攻擊（見圖6-b），而病毒對照組細胞基本死亡（見圖6-c），說明純化獲得的rchIFN-γ蛋白具有較好的抗病毒活性。

圖6 抗病毒活性測定中的細胞Fig.6 Cells in detection of anti-NDV activity of IFN-γ

3 討論

在家禽養殖生產中，預防禽類傳染性疾病主要采用疫苗免疫，但疫苗往往比較單一，而病毒卻復雜多樣且變異快，常導致疫苗未能達到很好的免疫效果，嚴重的還能導致人畜共患。在疾病的治療方面常常又會因為大量使用藥物引起一系列的藥物殘留和抗藥性的問題。因此研究一種新型的廣譜抗感染類生物制劑就迫在眉睫。干擾素因其作用機理的獨特性而具有廣譜的抗病毒活性和免疫增強作用。研究表明，重組干擾素與天然干擾素具有同樣的抗病毒和免疫調節活性[8]，因此重組干擾素的研究和應用將成為家禽養殖生產中增強雞的免疫，減少雞的疾病，降低雞的死亡率的重要方向。

李娜等用能夠在大腸桿菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞中表達的pQE trisystem載體表達了雞γ-干擾素，但是表達的融合蛋白主要以包涵體形式存在[9]；蔡梅紅等將雞γ-干擾素與pRLC原核非融合性表達載體重組并得到高效表達，其表達產物也主要以包涵體形式存在[10]；由于表達產物主要以包涵體形式存在，必須對包涵體成分進行復雜的變性復性處理。而本研究選用pProEXTMHTa表達載體，經過摸索并且采取了一系列措施直接對表達的可溶性蛋白在非變性條件下純化。如溫度控制在30℃，在超聲前加入甘油、PMSF等保護蛋白不被氧化從而維持它的活性。超聲波裂解后，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，結果總蛋白的50%左右以可溶性的形式存在，避免了包涵體的大量產生，從而解決了天然條件下分泌太少的缺陷，也避免了包涵體表達進行變性復性處理等復雜步驟。在脫鹽試驗中利用蛋白純化儀的脫鹽柱進行脫鹽，避開了傳統的透析，為雞γ-干擾素通過天然純化從而保持其活性提供了保證。

據文獻報道用原核載體表達真核基因，真核基因中信號肽的存在可能會在一定程度上影響其表達產物的生物活性[13]。蔡梅紅等只擴增雞γ干擾素成熟蛋白基因，而不是全基因序列[10]；戴華將含信號肽和不含信號肽序列分別與表達載體構建了重組大腸桿菌，最后表明去除chINF-γ基因信號肽序列的重組菌的表達產物能以可溶性和包涵體的形式同時并存[11]；齊靜構建重組表達質粒pET-32a（+）-chIFN-γ得到了大量的可溶性蛋白[12]。本研究在本實驗室構建好了的含有信號肽的重組質粒基礎上重新擴增出無信號肽的chINF-γ與pProEXTMHTa高效表達載體重組并進行表達。pProEXTMHTa表達載體中帶有6×His的標簽，可以和目的蛋白一起融合表達，因此表達產物可以通過鎳柱親和層析柱進行純化，純化rchIFN-γ蛋白濃度為 1.9 mg·mL-1；同時由于pProEXTMHTa載體中6×His標簽分子質量小，生理條件下不帶電荷，因而基本上不影響目的蛋白的結構與功能，從而使融合蛋白的生物學活性更高，利于以后的生產應用，這是在選擇表達載體時和以前的研究的不同之處，是本實驗創新之處之一。本試驗中用鼠源的6×His的單克隆抗體作為一抗，HRP的兔抗鼠抗體作為二抗可檢測到表達和純化rchIFN-γ蛋白在約20 ku處出現特異性顯色條帶。史喜菊等曾利用真核表達系統和原核表達系統同時構建了rBoIFN-γ的重組體，同時比較了兩者之間的活性，結果表明酵母表達的rBoIFN-γ蛋白的抗病毒活性大約為大腸桿菌表達的rBoIFN-γ蛋白抗病毒活性的2倍[13]，也就是說在活性方面，原核表達系統還是存在著不足之處。

通過CEF-NDV系統測定表明純化蛋白具有很好的抗病毒活性。水泡性口炎病毒作為活性檢測試驗中常被采用的病毒，但黃建寶利用NDV強毒株F48E9對復性后的IFN-γ進行了活性測定，結果表明純化的重組IFN-γ具有良好的生物學活性[14]。同時新城疫只需要在普通的細胞間操作，減少實驗過程中不少的繁雜工序，節約成本，所以本實驗采用了雞成纖維細胞-新城疫（新城疫Ⅳ系弱毒苗）（CEF-NDV）系統檢測重組IFN-γ的生物學活性。本實驗采用新城疫Ⅳ系弱毒苗對融合蛋白進行活性測定，也是本實驗的創新之處。這也為研究開發新型抗病毒制劑和免疫佐劑奠定了重要基礎。

4 結論

a.本試驗采用PCR方法成功克隆到編碼雞γ-干擾素（chIFN-γ）基因，與1995年Digby等人首次成功克隆的chIFN-γ基因序列進行比較，其同源率為100%。

b.采用原核表達系統成功表達了chIFN-γ融合蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析顯示，表達的雞IFN-γ融合蛋白分子質量約為20 ku，能與抗His的單克隆抗體發生特異性反應。

c.重組chIFN-γ融合蛋白經可溶性分析表明，表達的蛋白一部分形成包涵體，另一部分以可溶形式存在，可溶性蛋白經鎳柱在天然條件下的純化得率約為1.9 mg·mL-1。

d.利用利用雞成纖維細胞-新城疫（新城疫Ⅳ系弱毒苗）（CEF-NDV）系統測定的非變性條件下純化的重組chIFN-γ具有良好的抗NDV病毒活性，為研制新型抗病毒干擾素制劑奠定基礎。

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