民豬群體氟烷基因頻率檢測及序列多態性分析

魏 巍，王希彪，黃宣凱，張 野，蘭曉明，劉建明，暴 國

（東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

1991年Fujii發現豬應激綜合癥（Porcine stress syndrome,PSS）是蘭尼定受體基因（Ryanodine recetor gene RYR1）突變所致[1]，此突變是隱性突變，并認為此突變基因即為氟烷隱性基因（Haln）。PSS易導致豬應激而突然死亡或產生PSE肉[1]，給養豬業造成巨大的經濟損失，美國每年約損失2.3～3.2億美元[2]。研究表明Haln基因對豬的胴體性狀呈加性效應[3]，可使豬胴體重增加2%～3%，但又會減少窩產仔數和增加PSE肉的發生率[4-5]。

我國地方豬種攜帶Haln基因較少，李來記報道的二花臉豬Haln基因的頻率為0.57%、民豬Haln基因的頻率為15.62%、五指山和香豬Haln基因的頻率為0；陳蘊穎等報導的內江豬、版納豬和五指山小耳豬Haln基因的頻率也為0；方美英報道的姜曲海豬、內江豬、桃園豬和香豬Haln基因的頻率為0，民豬Haln基因的頻率為10%[6-8]。近年來對中國地方豬種Haln基因的研究，越來越多的采用測序的方法，如趙中權等分析了藏豬Haln基因序列及其多態性[9]；李來記等對二花臉、香豬MHS基因的DNA序列進行了比較[10]；帥素容等分析了內江豬、太湖豬、成華豬和雅南豬Haln基因序列并與國外豬種做了對比分析[11]，而民豬在此方面的研究一直未見報道。民豬具有抗逆性強、肌內脂肪含量高、肉質優良、高繁殖力等優點，其優良特性引起海內外的重視[12]，在世界地方豬種排行榜中名列第四位[13]，2000年將其列入國家畜禽品種保護名錄[14]。因此本文對Haln基因在民豬群體中的分布進行了檢測并測定了民豬Haln基因的序列，為合理利用Haln基因和民豬選種選配提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采自黑龍江省蘭西縣民豬保種基地，共48頭民豬個體。另外還查找了國內外不同品種豬Haln基因的相同區段，序列來源與編號見表1。

表1 試驗樣品或序列來源Table 1 Source of experimental samples or sequences

1.2 方法

1.2.1 取樣

用耳號鉗采集少量耳組織，裝入盛有75%酒精的離心管中，帶回實驗室-20℃保存備用。

1.2.2 DNA提取

1.2.2.1 配制裂解液

試驗用裂解液為本實驗室改良的配方，100 mL豬耳組裂解液的配制方法如下：1 mol·L-1Tris-Cl（pH 8.0）5 mL，0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）20 mL，2 mol·L-1NaCl 5 mL，10%SDS 10 mL，1%Pr-k 1 mL。

1.2.2.2 基因組DNA的提取

蒸餾水清洗耳組織并剪碎→55℃過夜消化耳組織→加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1混合液，顛倒萃取20 min→4 ℃，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液至一干凈的1.5 mL離心管中→加入等體積的酚：氯仿∶異戊醇=25∶24∶1混合液，顛倒萃取20 min→4 ℃，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液至一干凈的1.5 mL離心管中→加入等體積的氯仿∶異戊醇=24∶1混合液，顛倒萃取20 min→4℃，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液至一干凈的1.5 mL離心管中→加入2倍體積的預冷的無水乙醇，-20℃放置30 min→4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清→加入2倍體積的預冷的75%乙醇，4℃，12 500 r·min-1離心5 min；棄上清→晾干后，加入100 mL 0.1×TE，55℃溶解DNA→-20℃保存備用。

1.2.2.3 基因組DNA的檢測

用1.0%Agarose凝膠電泳檢測DNA的完整性，用紫外分光光度計測定其在OD260和OD280的光度值，通過OD260/OD280計算原液的純度，通過OD260×稀 釋 倍 數 ×50（ng·mL-1）計 算 原 液 濃度，-20℃保存DNA原液。

表2 引物序列、退火溫度及目的片段大小Table 2 Sequences,annealing temperature and size of motive frag

1.2.3 Haln基因的PCR擴增

引物序列采用Fujii等的研究成果[1]，由上海生物工程技術服務有限公司合成，具體信息見表2。

PCR擴增反應液（25 μL）組成如下：基因組DNA（100 ng·μL-1）2 μL，dNTP（2.5 mmol·mL-1） 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Haln-613-F（10 pmol·mL-1）1 μL，Haln-613-R（10 pmol·mL-1）1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.4 μL，加水補足至25 μL。PCR反應程序：95℃ 5 min，30×(95℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃45 s，72℃10 min，4℃保存。取PCR產物于1.2%Agarose凝膠電泳，切取600 bp左右處的片段，回收純化目的DNA，送至上海生物技術服務有限公司測序。

1.2.4 酶切

采用Hha Ι內切酶對擴增的Haln基因613 bp片段進行酶切，酶切反應體系組成如下：Hha Ι（10 U·μL-1）限制性內切酶 0.35 μL，10×buffer 2 μL，PCR產物5 μL，ddH2O補足至10 μL。酶切反應條件：37℃水浴4 h[16]。酶切產物用1.2%Agarose凝膠電泳，GoldView（GD）染色、凝膠成像儀成像拍照分析。

1.3 統計分析

用BioEdit等軟件分析所測樣本的序列，并與其他10個品種（系）的Haln基因相比尋找突變位點。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取結果

從豬耳組中提取的基因組DNA濃度約為2 735 ng·μL-1，其純度在1.7～1.9范圍之內，1%Agarose凝膠電泳圖譜中觀察，是一條光滑整齊的條帶（見圖1）。

圖1 DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of DNA

2.2 Haln-PCR擴增結果

經PCR特異性擴增的目的片段全長為613 bp，由電泳圖譜可見無雜帶（見圖2）。

2.3 Haln-Hha I酶切結果

結果見圖3。

PCR產物經限制性內切酶Hha Ι消化獲得的Haln基因座位3種基因型的特征帶型為：HalNHalN（NN）為500 bp和113 bp 2條帶；HalNHaln（Nn）613 bp、500 bp和113 bp 3條帶；HalnHaln（nn）只有1條613 bp帶（見圖3和表3）。

圖2 Haln基因PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of halothane gene

圖3 民豬Haln基因PCR產物Hha I酶切電泳Fig.3 Electrophoersis pattern of Hha I-RFLP of halothane gene's PCR products in Min pig

表3 民豬群體的Haln基因座位的基因型頻率和基因頻率Table 3 Genotypic frequency and gene frequency in halothane gene of Min pigs

2.4 PCR產物序列分析

對HalNN型民豬、太湖豬、內江豬、成華豬、雅南豬、長白豬、二花臉、香豬、藏豬、長白豬和皮特蘭豬的含C1843在內的614 bp Haln基因片段進行了序列分析與品種（系）間的比較，民豬Haln基因序列如下（見圖4和表4）。

圖4 民豬Haln基因PCR產物序列Fig.4 Sequence of PCR products of halothane gene in Min pig

表4 11個品種豬Haln基因部分片段DNA序列變異位點Table 4 Mutation sites in Halngene amino acid sequence of 11 varieties pigs

3 討論

自Fujii等確定了豬Haln基因的核苷酸序列和突變位點以來[1]，PCR-RFLP技術檢測Haln基因型變得日趨完善[17]，有的國家已建立了豬Haln基因的DNA檢測方法[18-20]，并在大范圍內對豬育種群體進行了Haln座位的基因型分析[18]，對有效控制豬群的Haln基因頻率起到了重要的作用[20]。雖然我國Haln基因DNA檢測技術和分子生物學分析剛剛起步，但隨著國外優良品種的引入和我國豬遺傳改良的進一步深入，以及瘦肉品種、品系的培育，Haln基因的研究將引起重視，并將得到應用和發展。

3.1 不同品種豬Haln基因座位的基因頻率

本研究中民豬的Haln基因頻率與國內報道有一定的差異，比方美英（10%）[8]、李來記（15.62%）[10]報道的Haln基因頻率稍大，這可能是由于隨機抽樣，隱性Haln基因的樣本過于集中，使試驗數據較高；或者是由于該樣本處于保種群體中，長期的近交使得Haln基因頻率增加。Fujii等證明了長白、杜洛克、皮特蘭等品種的Haln基因具有同一起源[1]，而關于民豬Haln基因的起源還未被證實，有待進一步研究。

3.2 不同品種Haln基因序列的種間差異

Fujii等通過對皮特蘭豬和約克夏豬的HalncDNA全序列比較[1]，發現18個單堿基的差異。本文通過對不同品種（系）Haln基因序列比較分析，發現不同品種（系）間Haln612序列存在差異：皮特蘭豬C1843→T1843；皮特蘭A1437→G1437；二花臉和皮特蘭C1544→T1544；皮特蘭 T1555→C1555；皮特蘭 C1582→T1582；長白-Brenig、藏豬和長白C1585→T1585，太湖豬、內江豬、成華豬長白-Brenig和二花臉A1588→G1588；成華豬 T1626→C1626；皮特蘭 C1674→G1674；皮特蘭 C1751→T1751；皮特蘭 C1800→T1800；皮特蘭 C1844→T1844；內江豬C1888→T1888；二花臉和皮特蘭G1981→A1981。在所比較的11個豬品種（系）間Haln基因的DNA序列差異均為單核苷酸的替換，未發現多堿基和大片段的插入、缺失和移框突變。除Fujii等確定的C1843→T1843的突變造成氨基酸替代（Arg615→Cys615）與豬PSS有關外，其他的引起氨基酸改變的堿基突變與豬PSS的關系還有待證實[1]。而本研究中所發現的品種間13個突變大部分可能屬于品種特異性改變，與豬PSS的發生是否有關還有待進一步分析。

4 結論

本試驗通過PCR-RFLP方法檢測了民豬群體中Haln基因的基因型頻率和基因頻率，結果表明民豬在長期的保種過程中HalnHaln型基因頻率有所增加，n基因頻率稍有升高。在比較民豬與其他品種豬Haln基因序列的區別時，發現皮特蘭與民豬的差異最大，內江豬與民豬的差別最小。這個結果可以很有效的說明皮特蘭豬肉質較差，而民豬肉質較好的原因。在實際生產中Haln基因給豬肉生產者和豬肉加工者帶來了巨大的損失，因此，通過遺傳育種選育抗應激的豬種具有實際意義。

[1] Fujii J,Otsu K and Zorzato F,et al.Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia[J].Scinece,1991,253:448-451.

[2] Brening B,Brem G.Molecular clocuing and analyais of the potcine"haloinabane"gene[J].Areh Tiera Dummeratcaf,1992,3215:129-135.

[3] 趙秀娟,帥素容.氟烷基因研究進展概述[J].畜禽業,2002(7):10-12.

[4] 蔣思遠,熊遠著,鄧昌彥,等.豬氟烷基因與成產性狀關系的初步研究[J].中國畜牧雜志,1995(5):20-21.

[5] 蔣思遠,熊遠著,鄧昌彥,等.豬RYR1基因的PCR-RFLP分析和氟烷基因利用的研究[J].中國畜牧雜志,1997,33(2):9-10.

[6] 李來記.豬MHS基因分子遺傳學基礎與應用研究[D].北京:中國農業大學,1996.

[7] 陳蘊穎,步宏,李幼平,等.中國內江豬的氟烷基因型[J].華西醫科大學學報,1999,30(2):117.

[8] 方美英,姜志華,劉紅林,等.不同豬種中氟烷基因頻率調查分析[J].浙江農業大學學報,1999,11(3):145-147.

[9] 趙中權,帥素容,楊顯彬,等.藏豬氟烷基因PCR-RFLP和序列多態性分析[J].農業生物技術學報,2008,16(1):51-54.

[10] 李來記,張沅,李寧.豬惡性高熱綜合征(MHS)基因群體檢測及部分片段DNA序列研究[J].中國畜牧獸醫學報,1996,16(6):540-545.

[11] 帥素容,李學偉,趙秀娟,等.中國6個地方豬種與3個外種豬氟烷基因PCR產物序列比較研究[J].中國畜牧雜志,2005,41(2):12-15.

[12] 中國豬品種志.中國豬品種志[M].上海:上海科學技術出版社,1986.

[13] 鄭兆利,王亞波,高健,等.民豬的雜交利用及產品開發的研究[J].中國豬業,2006,24(5):90-91.

[14] 農業部.國家級畜禽品種資源保護名錄[S].北京中國畜牧獸醫信息網,2001.

[15] Brenig B,Brem G.Genomic organization and analysis of 5’end of the porcine ryanodine receptor gene(yry1)[J].FEBS Letter,1992,298(2-3):277-279.

[16] Nakajima E,Matsumoto T,Yamada T,et al.Technicai note:use of a PCR-RFLP for detection of a point mutation in the swine ryanodine receptor(RYR1)gene[J].J Anim Sci,1996,74:2904-2906.

[17] Qtsu k,Philips M,Khanna V.Refinement of diagnostic assays for a probable causal mutation for porcine and human malignant hyperrhermin[J].Genomics,1992,13:835-836.

[18] Hughes I,Moran C,Nicholas F.PCR genotypiag of the rynnodine receptorgene forputative causalmutatton formalignant hyperthermta in Australian pig[J].J Anim Breed Genet,1992,109:466-476.

[19] Zhang X,Shen H,Cory C,et al.Demonstratron of the mutation associated wtth porcme stress syndrome[M].Ohnishi S T,Ohnishi T A genete membrane drsease.Boca Raton:CRC Press,1994:273-292.

[20] Dicksou D.DNA testmg helps British brtng better pig to market[J].Nature,1993,22(3):662-688.