豬ATIC基因SNPs位點分析和表達規律的研究

李金玲，李海濤，高麗峰，楊秀芹，劉 娣,2*

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086）

豬肉是我國最主要的食用肉類。近幾年來，隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對豬肉產品的要求也逐漸從量向質轉變，豬肉肉質的風味、營養和安全成為了人們評定豬肉品質的重要標準。目前，國內外大量研究表明，氨基酸（谷氨酸和甘氨酸效果最明顯）、肌苷酸和肌內脂肪與肉質風味密切相關。其中，肌苷酸是構成肌肉鮮味和香味的主要成分之一[1]，其鮮味強度是等量谷氨酸鈉的30倍[2]。目前，國際上已把肌苷酸含量作為影響肉質的重要指標[3－4]。因而影響肌苷酸生成的各種基因都是肉質性狀潛在的候選基因。

ATIC基因是編碼肌苷酸合成十步反應中最后兩步反應的酶基因。1995年Broad將綿羊的ATIC基因定位于2號染色體上[5]。人類的ATIC基因cDNA全長1 776 bp[6]。ATIC基因已在家雞中進行了較為深入的研究。Ni等克隆了雞ATIC基因的cDNA序列，全長2.3 kb[7]。本研究擬在分子水平上對民豬、北京黑豬、大白豬和長白豬的ATIC基因進行研究，探討不同品種豬之間風味特性的差異與ATIC基因的關系，為尋找與豬肉風味品質性狀緊密連鎖的有效分子遺傳標記奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

長白豬65頭、大白豬84頭均來自東北農業大學原種豬培育中心；北京黑豬50頭來自大慶采油四場豬場；東北民豬30頭來自黑龍江省蘭西種豬場。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集、基因組DNA和總cDNA的制備

民豬、北京黑豬、大白豬、長白豬4個豬種的基因組DNA樣品為實驗室保存樣品。3頭民豬購自黑龍江省農業科學院畜牧研究所，對其進行斷頸宰殺，采集子宮、背肌、腸、肺、脾臟、肝臟、心臟、脂肪、腿肌共9種組織和器官樣品。按照Trizol Reagent總RNA提取試劑盒操作說明提取這9種組織的總RNA，利用Promega公司的RQ1 RNase－Free DNase處理提取的總RNA，排除基因組DNA的影響，利用紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度，利用1.4%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量，PrimeScript RT reagen Kit說明書方法反轉錄成cDNA。

1.2.2 引物的設計

根據GenBank上發表的人ATIC基因的DNA序列（GenBank No:NC_000002）和豬 mRNA序列（GenBank No:NM_001130736）進行比對，找到ATIC基因的外顯子6，并設計PCR－SSCP多態性分析引物P1F/P1R；根據ATIC基因的mRNA序列設計Real time PCR擴增引物C1、C2，引物的相關信息見表1。

表1 引物相關信息Table 1 Information of primers

1.2.3 多態性檢測

以民豬、北京黑豬、大白豬、長白豬共214頭個體DNA為模板；進行PCR－SSCP反應，凝膠濃度為18%；電泳結束后，進行銀染，顯色。

1.3 ATIC基因的表達分析

1.3.1 Real－time PCR反應體系的建立

根據寶生物工程（大連）有限公司的SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒構建20 μL反應體系，采用兩步法Real－time PCR反應程序，每個樣本重復3次，根據標準曲線以及熒光曲線Ct值計算定量結果。

1.3.2 定量標準曲線的繪制

分別取已制備的豬9種組織cDNA樣品（50 ng·μL－1）各1 μL進行混合，利用寶生物工程(大連)有限公司的EASY Dilution試劑按10倍濃度梯度稀釋為5、500、50、5、0.5 pg·μL－1。分別取 2 μL，對1 pg～100 ng的cDNA制作標準曲線。

1.3.3 數據分析

BLAST方法進行同源性比對，使用SPSS軟件進行t檢驗和χ2檢驗、用PIC_Calc 0.6軟件進行PIC值計算。

2 結果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測結果

P2F/R引物的擴增產物經PCR－SSCP檢測后，共發現三種基因型，兩種純合型分別命名為AA、BB。對兩種純合型個體進行克隆測序發現，A等位基因在452、477、488 bp處的核苷酸分別為A、A、G；B等位基因在452、477、488 bp處的核苷酸分別為G、G、A（見圖1）。

圖1 PCR-SSCP電泳圖譜Fig.1 PCR-SSCP electrophoresis pattern

2.2 群體遺傳學分析

針對以上PCR－SSCP檢測結果，分析各基因型在北京黑豬、長白豬和大白豬等豬種中的分布規律。各品種的檢測個體數、基因型頻率、基因頻率、多態信息含量（PIC）等統計參數值（見表2）。

χ2獨立性檢驗表明在所檢測的各多態位點，不同基因型在民豬、北京黑豬、長白豬和大白豬等4個品種間的分布存在極顯著差異（P＜0.01）。χ2分割檢驗結果見表3。

2.3 ATIC基因在不同組織中的表達情況

2.3.1 Real－time PCR定量檢測民豬9種組織中ATIC基因的表達

經過內參β－actin對豬9種組織中ATIC基因表達量的校正，發現ATIC基因在肝臟、腿肌、肺等組織中表達量較高，按照表達量從高到低依次為：肝臟＞腿肌＞肺＞心臟＞脾臟＞脊肌＞脂肪＞腸＞子宮，各組織表達譜及統計分析結果（見圖2）。

表2 不同品種豬ATIC基因的基因型頻率和基因頻率Table 2 Allele ferquencies and genotype frequencies of ATIC among different swine breeds

表3 ATIC各基因SNP位點在不同群體中的基因型分布的χ2檢驗Table 3 Chi-square testing of ATIC gene for genotype distribution of SNPs between breeds

圖2 民豬9種組織中ATIC基因的表達情況Fig.2 Expression of ATIC in nine kinds of tissues of pig

3 討論

肌苷酸合成過程中涉及10種酶，其中ATIC是具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸轉甲酰基酶和次黃嘌呤核苷酸環水解酶催化活力的雙功能酶，并且是唯一一個編碼兩種酶催化活力的雙功能酶[9]。在雞中對ATIC基因與肉質風味關系研究有很多，研究表明，該基因多態性與肌苷酸含量有關[10]。2005年，劉長青對部分雞種ATIC基因cDNA全序列進行分子掃描，認為該基因是影響雞肉風味性狀的主效基因或是控制此性狀主效基因的連鎖標記基因[8]；2008年束婧婷對5個雞種的ATIC基因進行分子掃描，認為該基因可能是控制雞肉風味性狀的主效基因或與主效基因連鎖[10]。

本文通過對豬ATIC基因外顯子6進行多態位點掃描，并應用PCR－SSCP技術進行遺傳學分析，發現不同基因型在民豬、北京黑豬、長白豬和大白豬等4個豬種間的分布存在著極顯著差異（P＜0.01）。并通過實時熒光定量PCR方法檢測了ATIC基因在各組織中的表達差異，研究發現肝臟、腿肌、肺等組織中高表達，其中以肝臟中的表達量最高。從這一結果可以看出，肝臟在肌苷酸合成過程中具有重要的生理作用。

在本試驗所檢測4個豬種中長白豬和大白豬均以A等位基因為主，其中大白豬沒有檢測到B等位基因，而我國地方豬種民豬和北京黑豬則以B等位基因為主。多態信息含量（PIC）的分析結果表明長白豬和大白豬均為低度多態（PIC＜0.25），而民豬和北京黑豬為中度多態（0.25＜PIC＜0.5），表明民豬和北京黑豬的遺傳基礎比較廣泛，遺傳多樣性好于長白豬和大白豬。

在本研究所檢測到的三個突變位點中，兩處為錯義突變，一處為非錯義突變，其中452 bp處的錯義突變造成了氨基酸極性的改變，由親水性的半胱氨酸代替了疏水性的酪氨酸。477 bp處為非錯義突變，488 bp處的錯義突變造成絲氨酸被天冬酰胺替代。

由于缺乏相應個體肌苷酸含量的數據，本研究所得多態位點是否是不同豬種肉質風味差異的影響因素之一尚有待于進一步驗證。

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