民豬PGD和LDHA基因的表達與冷誘導研究

張冬杰，劉 娣，汪亮，王文濤，楊國偉

（黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086）

葡萄糖－6－磷酸脫氫酶（Glucose－6－phosphate dehydrogenase，G6PDH）與6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6－phosphaogluconate dehydro－genase， 6PGDH）是植物戊糖磷酸途徑中的兩個關鍵酶。G6PDH的胞質基因與動物和真菌等真核生物具有共同的祖先；6PGDH的胞質酶和質體酶基因都起源于原核生物的內共生[1]。在甜楊上的研究結果表明，低溫下G6PDH的活性會顯著的提高[2]。在人醫上主要是研究該酶在紅細胞內活性降低和（或）酶性質改變而導致的溶血性疾病。豬的PGD基因（6－phosphogluconate dehydrogenase）最初是從肝臟組織的cDNA文庫分離獲得的，并通過原位雜交的方法定位在6q2.5－2.7[3]，而后的研究認為它與肌肉的硬度也存在一定的相關性[4]。

乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）是動物體內參與糖酵解的重要酶類，能催化丙酮酸與乳酸的相互轉變。LDH為四聚體，由M、H兩個亞基組成（分別由A和B基因編碼），共有5種同工酶形式LDH1～LDH5[5]。目前有關LDH的研究已較多，涉及到基因定位和蛋白質晶體結構以及基因表達調控等方面[6－8]。在分子進化方面，Holland等初步研究了LDH對溫度的適應性[9]；Glenn和Peter等通過對幾種不同的冷水魚在不同溫度下LDHA的氨基酸序列以及酶動力學研究發現[10－11]，抗冷與不抗冷品種之間，在氨基酸序列上僅存在1～4個點突變，但這些點突變位于活性區域內，通過精細的構象改變，改變蛋白質的氫鍵網絡，影響蛋白質的靜電分布或構象彈性，從而導致蛋白質功能的改變。在綜合分析了PGD和LDHA基因已有的生物學功能研究報道，本研究將其作為可能影響民豬抗寒特性的候選基因進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

75日齡民豬3窩共計12頭，將每窩個體隨機分成2組即常溫組和低溫組，每組各6頭，均購自黑龍江省農科院畜牧研究所。2009年12月25日到2010年1月6日期間，將常溫組置于正常舍內飼養，溫度控制在10℃左右，低溫組在舍外半敞式大棚內飼養，平均溫度為－20℃，兩組均飼喂相同的飼料。處理結束后，屠宰，取大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟各10 g左右，液氮帶回實驗室，－80℃冰箱凍存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與反轉錄

按照TRIZOL試劑的操作手冊進行大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的RNA提取，獲得RNA后，進行質量和濃度的測定，隨后參照反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，合成后－20℃儲存備用。

1.2.2 引物的設計與合成

根據GenBank上已公布的豬的PGD基因（X16638）、LDHA基因（AK236433）和β－actin基因（AK240355）序列設計引物，引物序列如下：PGDF： 5'GTGTTCCTGGGCAAGATAAA 3'， PGDR：5'AGAAGGAGAGGGCAGTGGT 3'；LDHAF：5'TGT GGCTTGGAAGATAAG 3'， LDHAR： 5'GAGACAC CAGCAACATTTA 3'； actinF： 5'CGGGACCTGACC GACTACCT 3'，actinR：5'GGGCCGTGATCTCCTTC T G 3'。送交上海生工合成。

1.2.3 Real－time PCR反應體系與反應條件

反應體系：上、下游引物各0.8 μL，Mix 10 μL，模板0.8 μL，H2O 7.6 μL，共計20 μL。反應程序如下：95℃10 min，95℃30 s，60℃1 min，40 個循環。試驗結果表示為 2－△△ct，其中ΔΔCt=（Ct，的基因－Ct，管家基因）試驗組－（Ct，目的基因－Ct，管家基因）對照組。

反應條件：95℃10 min，40個循環：95℃15 s，60℃1 min，循環終止，加熔解曲線。

1.2.4 PGD和LDHA基因組織表達譜的構建

將常溫組不同個體的大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的cDNA分別混合，獲得了7個cDNA池，分別以這7個cDNA池為模板，進行PCR擴增，PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 PGD和LAHDA基因冷誘導后表達變化

將常溫組和低溫組不同個體的腿肌的cDNA分別混合，獲得2個cDNA池，分別為常溫民豬（CM）和低溫民豬（DM）組。以這2個cDNA池為模板，進行Real－time PCR反應，每個反應重復3次。

2 結果與分析

2.1 民豬PGD基因的組織表達譜

民豬的PGD基因在不同組織內擴增的PCR結果見圖1。從圖1可見，PGD基因在所檢測的7個組織內均有表達，而且表達水平均較高。

第1～7泳道:β-actin基因在大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的表達水平；第8泳道:DL2000 Marker；第9～15泳道:PGD基因在大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織的表達水平Lane 1－7:The expression of β-actin gene in large intestine,leg muscle,lung,fat,heart,spleen and liver;Lane 8:DL2000 marker;Lane 9－15:The expression of PGD gene in large intestine,leg muscle,lung,fat,heart,spleen and liver

2.2 民豬LDHA基因的組織表達譜

民豬的LDHA基因在不同組織內擴增的PCR結果見圖2。從圖2可見，基因在所檢測的7個組織內均有表達，在肺和肝臟的表達水平略高。

圖2 LDHA基因的組織表達譜Fig.2 Expression pattern of LDHA

2.3 冷誘導后PGD和LDHA基因的表達變化

利用Real－time PCR方法對PGD和LDHA基因在常溫民豬（CM）和低溫民豬（DM）的腿肌內的表達變化進行了檢測，PGD和LDHA基因的擴增曲線和熔解曲線見圖3和圖4。檢測結果如圖5和圖6所示，采用配對樣本T檢驗統計分析后發現，PGD基因在民豬的常溫組和低溫組之間差異顯著（P＜0.05）?？梢?，民豬的PGD基因在低溫冷誘導后表達顯著增加；而LDHA基因在低溫冷誘導后表達顯著降低（P＜0.05）。

圖3 PGD基因的擴增曲線和溶解曲線Fig.3 Amplification plots and dissociation curve of PGD

圖4 LDHA基因的擴增曲線和溶解曲線Fig.4 Amplification plots and dissociation curve of LDHA

圖5 低溫誘導后PGD基因的表達變化Fig.5 Expression of PGD gene after cold-induced

圖6 低溫誘導后LDHA基因的表達變化Fig.6 Expression of LDHA gene after cold-induced

3 討論與結論

PGD基因廣泛表達于哺乳動物、植物和微生物。該酶位于動物細胞的胞質溶膠和線粒體上，位于植物的葉綠體上。它廣泛的表達于所有組織和血細胞內，是一種看家酶[12]，是磷酸戊糖旁路代謝的起始酶，它提供戊糖用于核酸合成，提供還原型輔酶Ⅱ（NADPH），用于各種生物合成及維持血紅蛋白和紅細胞膜的穩定性[13]。血細胞中缺乏PGD，臨床上通常會表現為溶血性貧血。本試驗所檢測的大腸，腿肌、肺、脂肪、心臟、脾臟和肝臟組織內，該基因均高水平表達，這一點與其他已知的看家酶特點相符，說明該基因在民豬上的表達并不存在組織特異性。但馬建崗在家雞上的研究顯示PGD在家雞胚胎期和未成年之前不顯示明顯的同工酶區帶[14]，成年之后僅在部分組織中出現活性帶；任立杰等也發現PGD在奶牛泌乳7 d時的活性要顯著高于其他時間點[15]，這說明PGD基因的表達在不同物種間還是存在一定差異的。在本研究中，民豬經低溫冷誘導后，肌肉組織中的PGD基因的表達水平顯著升高。因為該基因在豬上以及其他哺乳動物上的相關研究報道非常少，主要都集中在對人的PGD缺乏癥的篩查、治療和機理研究上[16－17]。但是在植物上關于該基因的研究報道較多，所以我們參考了在植物上的相關研究結果。2009年林元震等報道了楊樹G6PDH基因啟動子區序列，他們發現該序列除了具有啟動子的基本元件TATA－box、CAAT－box外，還包含多個脅迫誘導元件，如低溫誘導元件LTR，抗凍、缺水、脫落酸、抗寒元件MYB和MYC，以及光響應元件L－box、G－box、3AF－1、TC豐富區等[18]。而且該基因的超表達，可以顯著提高煙草的抗寒凍性[19]。但由于目前豬的PGD基因序列還不全，還無法進行更深入的研究，但從本結果來看，將其作為一個影響民豬抗寒特性的候選基因進行研究具有一定的理論基礎和實際意義。

脫氫酶類是生物體內氧化還原反應中重要的催化劑之一，在生物體內的氧化產能、解毒以及某些生理活動中起著十分重要的作用，在生產實踐中也有廣泛的應用。在不同的組織中各種組分的含量和比例有所不同，它是各組織生化代謝特點的反映[20]。L－乳酸脫氫酶（E.C.1.1.1.27）是由基因分別位于第11號染色體上的M亞基、第12號染色體上的H亞基形成的多肽鏈所構成的四聚體，由于各亞基在不同的組織中各種組分的含量和比例不同，形成了 LDH1（H4），LDH2（H3M1），LDH3（H2M2），LDH4（H1M3）和LDH5（M4）等5種同功酶[21]。本研究所選擇的LDHA也就是編碼M亞基的基因，因此，它也被稱作LDH-M。本研究中，LDHA基因在肺和肝臟組織的表達水平略高于所檢的其他5個組織，艾曉杰等在對白香豬的研究中發現，肺、脾和肝臟組織中M亞基與H亞基相比略高或相同，而在腎臟和大腸中，均是H亞基占優勢[22－24]?？梢?，民豬與白香豬相比，LDHA的表達模式基本一致。

乳酸脫氫酶是一個較為公認的與生物個體抗寒性有關的酶類，其在關鍵鉸鏈區的一個氨基酸替換就可以顯著改變生物個體的抗寒性[25]。本研究將其作為一個可能為影響民豬抗寒性的候選基因進行了研究，結果表明，民豬在被冷誘導后，肌肉組織內的LDHA基因的mRNA水平出現了顯著的下降。這一結果與史福勝等人在對不同海拔地區的牦牛組織中LDH的活性研究結果基本一致[26]。LDH不僅能夠催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉化，而且還能夠調節煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADH）的比率，因而對細胞內的一系列生化反應起調節控制作用[27]。可見，當民豬處于低溫環境時，它通過下調LDHA基因的轉錄來達到抵御寒冷的目的。

綜上所述，葡萄糖－6－磷酸脫氫酶在民豬的肌肉組織中受到低溫冷誘導后，mRNA的表達水平顯著增加，而乳酸脫氫酶A表達水平顯著下降，二者均可以考慮作為影響民豬抗寒特性的候選基因進行研究。

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