豬TPST1基因的克隆、序列分析及真核表達載體的構建

別 墅，孫洪濤，張冬杰，汪 亮，劉 娣,*

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院，哈爾濱 15008）

硫酸化是蛋白質中的酪氨酸殘基翻譯后而進行的加工過程，起修飾作用[1]，硫化后的酪氨酸是蛋白質與蛋白質結合、白細胞粘附的重要決定因子[2]。此反應受到高爾基體酶-酪氨酸硫化轉移酶（Tyrosyl-protein sulfotransferase， TPST）的 調 節 ，TPST為膜內蛋白，其活性中心朝向高爾基復合體腔，廣泛存在于大多組織細胞中[3]。作用是將與二磷酸腺苷相結合的帶負電荷的硫基團，轉移給酸性氨基酸附近的酪氨酸殘基[4]。有關TPST基因功能的研究較少，有報道炎癥刺激會影響TPST的轉錄[5]。本研究采用電子克隆結合RT-RCR的方法，首次克隆和分析了豬的TPST1基因的完整序列，成功構建了TPST1基因的真核表達載體，為進一步分析該基因功能、遺傳標記及細胞功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

民豬3頭，采集背肌組織樣，迅速凍于液氮里帶回實驗室，-80℃保存備用。

1.2 RNA提取及cDNA合成

使用Invitrogen公司的Trizol kit分別提取各組織的總RNA，然后按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit操作手冊，使用該試劑盒將所提取的各組織RNA反轉錄成cDNA。

1.3 引物設計與真核表達載體構建

應用BLAST（Blastp，TBlastX，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上執行序列同源性搜索，尋找其他物種已有的TPST1相關核酸序列，進行序列比對。在高度相似區（NM_003596.3）設計了1對引物用于 RT-PCR 擴增。F1:5′（HindⅢ）AAGCTTAT GGTTGGAAAACTGAAGCAG 3′，R1：5′（Bam HⅠ）GGATCCTGTTCTACAAAACATTAGAACATGT3′。以民豬背肌cDNA為模板降落式RCR進行擴增，94℃ 10 min，94℃ 30 s，64℃ 30 s，-1℃/cycle，72 ℃ 2 min，go to 2，16 cycles，94 ℃ 30 s，48 ℃30 s，72 ℃ 2 min，go to 6，15 cycles，72 ℃ 10 min，4℃ forever。擴增出特異片段經純化后連入pMD18-T sample載體，轉化入大腸桿菌后，涂于含有Amp的LB固體培養基上過夜培養，培養結束后，挑選陽性克隆菌落提質粒，雙酶切（Bam HⅠ/HindⅢ）鑒定后，送上海生工測序。確定序列正確后與pcDNA3.1（+）表達載體質粒分別用限制性Bam HⅠ/HindⅢ內切酶酶切，回收純化后，使用T4DNA ligase 16℃過夜連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α中，提取質粒，酶切鑒定并測序。

1.4 分子進化樹的構建

從NCBI數據庫檢索到的人、大鼠、小鼠、牛、原雞等10種動物的TPST1基因與克隆的豬TPST1基因進行多重序列比對，構建分子進化樹。

1.5 生物信息學分析

應用DNAStar 5.0軟件的ClustalW對包括豬在內的其他物種的TPST1基因序列進行比對分析；利用Lasegene的protean分析TPST1蛋白質的二級結構；應用MEGA3.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 民豬TPST1基因克隆測序

以民豬的背肌cDNA為模板，擴增出1 543 bp片段序列（見圖1）。

圖1 豬TPST1 cDNA PCR擴增產物電泳Fig.1 Electrophoresis of porcine TPST1 cDNA PCR product

利用DNAstar軟件預測其完整的CDS長度為1 113 bp，其起始碼子為ATG，終止密碼子為TAG，編碼370個氨酸，蛋白質的理論等電點（pI）為9.0，相對分子質量為42.13 ku，多肽鏈含有50個強堿性氨基酸殘基，40個強酸性氨基酸，129個疏水性氨基酸殘基，80個極性氨基酸殘基（見圖2）。

圖2 豬TPST1基因cDNA序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence of porcine TPST1 and the deduced amino acid sequence

2.2 真核表達載體結果分析

將該序列與pcDNA3.1（+）表達載體連接后，成功提取到質粒，雙酶切鑒定和測序結果證明真核表達重組質粒pcDNA3.1（+）-TPST1構建成功，結果見圖3。

2.3 同源性及分子進化分析

應用ClustalW軟件將豬與另外10個物種TPST1氨基酸序列進行比對分析發現，與牛（97.6%）、小鼠（96.8%）、大鼠（97%）、人（97.03%）等物種均具有較高的一致性。MEGA3.0軟件對TPST1蛋白質的物種間系統進化樹分析亦表明豬與大鼠、人、獼猴、猩猩親緣關系較近位于第一個分支，馬和原雞與其親緣關系較遠屬于另一個分支（見圖4）。

圖3 pcDNA3.1（+）-TPST1載體雙酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid of pcDNA3.1（+）-TPST1

圖4 TPST1基因的物種間系統進化樹分析Fig.4 Analysis of phylogenetic relationship of TPST1 gene among species

3 討論與結論

1998年人的TPST1 cDNA序列被克隆出來，包含370個核苷酸，是一種糖蛋白內有兩個N-連接的糖基化位點，沒有O-連接的糖基化位點[7]。研究者們發現在有機體的總蛋白中約有1%的酪氨酸殘基被硫酸化，

此修飾影響分泌型蛋白的細胞內轉運和一些神經肽的生物學活性[8]。酪氨酸硫酸化具有高度的選擇性，能識別含有酸性氨基酸、酪氨酸暴露的蛋白質區域，可增強酪氨酸硫化轉移酶與其作用的親和力[3]。TPST1翻譯后受到酪氨酸硫化修飾的調節，硫化抑制劑shRNA可以顯著抑制TPST的活性[2]。李傳友等發現TPST基因在植物根尖干細胞維持中起重要作用[9]，也研究表明TPST基因能夠調控植物的生長發育，在動物的許多生理及病理過程中起著非常重要的作用，如激素調節、生理止血、炎癥、感染性疾病等。

經分析豬TPST1基因其完整的CDS長度為1 113 bp，編碼370個氨基酸,蛋白質的理論等電點（pI）為9.0，相對分子質量為42.13 ku，多肽鏈含有50個強堿性氨基酸殘基，40個強酸性氨基酸，129個疏水性氨基酸殘基，80個極性氨基酸殘基，酪氨酸為12個。構建進化樹分析，民豬TPST基因的編碼的氨基酸序列相對保守，與人、鼠、牛、犬、猩猩都具有較高的一致性96%以上，屬于第一個分支；與原雞、馬親緣關系較遠一致性在88%左右。

本研究首次克隆獲得1 543 bp的民豬TPST1基因并登錄NCBI（HQ439987），其完整的CDS長度為1 113 bp。在此基礎上成功構建pcDNA3.1（+）-TPST1重組質粒，為后續試驗研究TPST1基因調節酪氨酸硫酸化的作用機制，及在東北民豬的生長發育、抗炎癥、抗逆等性狀研究方面有著十分重要的意義。

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