COX-2在上皮性卵巢腫瘤的表達及塞來昔布對卵巢癌A2780細胞株凋亡的影響

徐曉輝， 申愛榮

化療在卵巢癌治療中占重要地位，部分卵巢癌患者對常規使用的化療藥物耐藥，是目前化療后卵巢癌患者5年存活率低的原因之一。近年來的研究發現，COX-2在結腸癌及胃癌組織中高表達，并與患者的預后呈顯著負相關［1］。我們采用免疫組化法檢測COX-2在上皮性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的表達，了解COX-2是否參與上皮性卵巢腫瘤的發生發展過程，并研究COX-2抑制劑塞來昔布(celecoxib)在體外對人卵巢癌細胞株A2780細胞凋亡的影響，或可能為上皮性卵巢癌的防治帶來新思路。

1 臨床資料與分組

組織標本收集自河南省婦幼保健院病理科保存的2007年1月至2009年2月的原發上皮性卵巢腫瘤石蠟標本101例及正常卵巢組織9例。其中上皮性卵巢癌65例(惡性卵巢腫瘤組)，患者年齡27～74(56.4±7.8)歲，術前均未接受過化療或放療。交界性上皮卵巢腫瘤18例(交界性卵巢腫瘤組)，患者年齡32～62(43.2±6.7)歲。良性卵巢腫瘤18例(良性卵巢腫瘤組)，患者年齡20～53(38.5±4.78)歲。選擇同期行子宮肌瘤切除術的9例患者的部分正常卵巢組織作為對照(正常卵巢組)。所有標本病理診斷明確。標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續5 μm切片。人卵巢癌細胞株A2780由華中科技大學同濟醫學院婦產科李紅雨博士惠贈。

2 實驗材料與方法

2.1 材料來源

兔抗人COX-2抗體、SP試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購至福州邁新生物技術公司。RPMI-1640細胞培養基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)均購自GIBCO公司。塞來昔布膠囊，0.2 g×6粒/盒，購自美國輝瑞制藥公司。

2.2 方法

2.2.1 免疫組化染色 所有標本石蠟切成5 μm切片，以SP法進行免疫組化染色，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)代替一抗作為空白對照，用肺癌標本作為陽性對照。

2.2.2 A2780細胞培養 培養基為10%小牛血清的RPMI-1640，置于含37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次。

2.2.3 卵巢癌細胞株A2780細胞的免疫組化RPMI-1640培養基常規培養A2780細胞，倒置顯微鏡下觀察，取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，將細胞涂到用多聚賴氨酸處理過的玻片上，PBS沖洗，2×1 min;95%乙醇固定10 min，以SP法進行免疫組織化學染色。

2.2.4 流式細胞儀(FCM)檢測塞來昔布對A2780細胞凋亡的影響 實驗組細胞培養時加入不同濃度的塞來昔布(0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L)，并設不加細胞的空白組和只加等體積DMSO的對照組。培養48 h后用0.25%胰酶消化制成細胞懸液，DNA片段抽提染色，并盡快使用流式細胞儀分析凋亡率。每種刺激條件的樣本均采用三管法檢測，每例樣品測定10 000個細胞。

2.3 免疫組化結果判定

在×400倍光鏡下至少觀察10個視野，陽性細胞數≥10%判定為陽性;陽性細胞數＜10%判定為陰性。

2.4 統計學處理

采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用Tamhane法，取α=0.05為檢驗水準。

3 結果

3.1 COX-2在各種卵巢組織中的表達

圖1 COX-2在上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(×400)

COX-2免疫組化反應物質均位于細胞漿，主要彌漫分布于整個胞漿或沿核膜線狀分布，見圖1。COX-2在惡性(73.8%)及交界性(66.7%)卵巢腫瘤組中的表達顯著高于良性卵巢腫瘤組(16.7%)及正常卵巢組(11.1%)(P＜0.05)。惡性與交界性卵巢腫瘤組組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 COX-2在各種上皮性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的表達

3.2 塞來昔布對人卵巢癌A2780細胞株凋亡誘導情況

經流式細胞儀PI染色DNA含量分析，在DNA直方圖可見明顯的凋亡峰(亞G1峰)，對亞G1峰進行定量分析，計算細胞凋亡率。塞來昔布藥物濃度在 200 μmol/L、400 μmol/L 和 800 μmol/L 作用48 h，細胞凋亡誘導作用均明顯增強，細胞凋亡率分別為57.54%、62.61%和 99.88%(見圖 2 ～4)，與對照組(凋亡率為0.09%)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。隨著塞來昔布濃度增加，凋亡峰也隨之升高，且塞來昔布呈劑量依賴誘導A2780細胞凋亡。數據見表2和圖5。

圖2 200 μmol/L塞來昔布作用48 h，細胞凋亡率為57.54%

圖3 塞來昔布400 μmol/L作用48 h，細胞凋亡率為62.61%

圖4 塞來昔布800 μmol/L作用48 h，細胞凋亡率為99.88%

表2 不同濃度塞來昔布作用48 h誘導A2780細胞凋亡率(±s)%

表2 不同濃度塞來昔布作用48 h誘導A2780細胞凋亡率(±s)%

注:(1)單因素方差分析，F=3990.556，P ＜0.05(2)Tamhane法組間兩兩比較結果，任何實驗組與對照組(a組)比較:P ＜0.05

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圖5 不同濃度塞來昔布誘導A2780細胞凋亡率

4 討論

COX-2是分解花生四烯酸生成各種內源性前列腺素過程中的重要限速酶。目前研究認為，COX-2在靜息時并不表達，在細胞受到生長因子、細胞因子、促癌劑等刺激時則迅速合成，參與多種病理生理過程［2］。近年來的研究表明COX-2參與了肺癌等眾多腫瘤的發生發展［1，3］。

本研究結果顯示，COX-2在交界性及惡性上皮性卵巢腫瘤的陽性表達(分別為73.8%和66.7%)顯著高于良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織(分別為16.7%和 11.1%)(P ＜0.05)，與 Menczer等［4］的報道一致，說明COX-2的陽性表達率隨卵巢腫瘤惡性程度的增加而增高，提示COX-2過表達可能參與交界性及惡性上皮性卵巢腫瘤的發生。

Lee等［5］研究表明，COX-2在卵巢癌的高表達與血管內皮生長因子(VEGF)的表達呈明顯正相關，提示COX-2可能通過刺激腫瘤VEGF生成以參與卵巢癌的發生發展。Raspollini等［6］研究表明卵巢癌組織中COX-2過表達與化療敏感性呈顯著負相關，提示在卵巢癌患者臨床治療中，COX-2抑制劑與常規一線化療藥物聯合應用能夠提高腫瘤化療敏感性。

本研究結果顯示，塞來昔布呈劑量依賴方式誘導體外卵巢癌A2780細胞凋亡。Vital-Reyes等［7］研究發現塞來昔布在體外以劑量依賴性方式抑制CAOV3、OVCAR3和SKOV3等腫瘤細胞的生長和增殖，并誘導他們表達caspase-3的上調，參與腫瘤細胞凋亡過程。Kim等［8］研究表明塞來昔布能夠作為化療增敏劑用于陰道細胞癌的臨床化療。本研究采用SP法檢測COX-2在A2780細胞株中呈陽性高表達，由此推斷塞來昔布在體外誘導A2780細胞凋亡的機制可能是COX-2依賴性。

目前關于COX-2抑制劑抗腫瘤機制還不清楚，認為可能是通過以下機制發揮效應:(1)抑制PGE2的合成。Li等［9］研究發現特異性COX-2抑制劑尼美舒利呈劑量依賴性方式抑制小鼠體內SKOV-3卵巢腫瘤細胞的生長，該效應與腫瘤組織內PGE2水平降低有關。(2)抑制腫瘤新生血管的生成。Lee等［5］研究表明，COX-2可能通過刺激腫瘤VEGF的過表達參與卵巢癌的發展。(3)抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。Vital-Reyes等［7］研究證實塞來昔布以劑量依賴方式顯著抑制體外培養的卵巢癌細胞增殖，并誘導腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，COX-2在卵巢癌細胞中高表達，其可能在交界性及惡性上皮性卵巢腫瘤的發生發展中起關鍵作用，但是否成為腫瘤標記物尚需大樣本的實驗進一步闡明。另外，特異性COX-2抑制劑塞來昔布也有可能用于惡性上皮性卵巢癌的治療。

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