一種簡便的大鼠肝臟星狀細胞分離培養方法及鑒定

張榮濤， 李向農

原發性肝癌與肝硬化的關系密切，而肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)在肝硬化的發生發展中起重要作用。HSCs活化后可以分泌大量細胞外基質及細胞因子［1］。20世紀80 年代 Knook等［2］最早用鏈酶蛋白酶、膠原酶灌注消化的方法分離得到HSCs。但是分離方法復雜，條件苛刻，尤其是酶灌注時間及密度梯度離心液的精確配置不易把握。目前現有的許多分離方法需要特殊的循環設備及昂貴的密度梯度離心液。本研究借鑒國內外先進的HSCs分離方法［3-5］，經過多次實驗，探索出一種簡單、經濟、可靠的HSCs分離方法，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠20只，體重400～500 g，徐州醫學院實驗動物中心提供。普通飼料喂養，自由進食。實驗前12 h禁食。

1.1.2 主要試劑 Ⅳ型膠原酶、鏈酶蛋白酶、Percoll、DNA酶(均是sigma產品)，DMEM高糖型培養基、PBS(北京索萊寶公司)，胎牛血清(無支原體級)(杭州四季青)，Desmin抗體(bioword)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 液體配制 (1)灌注酶:鏈酶蛋白酶100 mg，Ⅳ型膠原酶 50 mg，D-Hanks 100 mL。(2)消化酶:Ⅳ型膠原酶

50 mg，鏈酶蛋白酶20 mg，DNA酶10 mg，D-Hanks 100 mL。(3)密度梯度離心液:9份Percoll加 1 份 1.5M PBS，配置成 100% 的 Percoll。用0.15M的PBS將100%的Percoll稀釋至39.5%，pH=7.4;用密度計測量密度并調整至1.053，濾器過濾。

1.2.2 HSCs的分離 SD大鼠用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。碘伏消毒切口皮膚。腹部十字型切口入腹，入腹后暴露門靜脈，結扎肝動脈、膽總管。在門靜脈遠心端用眼科剪做“V”型切口，置入硬膜外麻醉用導管，結扎固定后連接輸液器。同時在下腔靜脈做一小切口，插入硬膜外導管，結扎固定，作為出液端。實驗前將D-Hanks液、灌注酶、消化酶水浴至37℃。先用100 mL(含2 U/mL肝素)的D-Hanks經門靜脈插管灌注肝臟，灌注時間約15 min。待肝臟變為土黃色時，改用50 mL灌注酶緩慢灌注。將下腔靜脈插管的出液端置于培養皿，收集流出的灌注酶，供重復灌注使用。灌注大約30 min(重復灌注3～5次)，至肝臟軟化時，剪下肝臟，置于培養皿。20 mL D-Hanks清洗3次，去除肝臟表面殘留灌注酶。剔除肝包膜及結締組織，剪碎肝組織;加入30 mL預熱的消化酶，消化20 min，可見肝組織變成細胞懸液，再加入1 mL胎牛血清終止消化。將細胞懸液用200目篩網過濾，移入50 mL離心管，2 500 r/min離心 5 min，棄上清;3 mL D-Hanks懸浮沉淀，重復離心1次，棄上清;沉淀用6 mL DMEM懸浮，制成細胞懸液。取2個10 mL玻璃離心管，各加入5 mL密度梯度離心液，吸取3 mL細胞懸液緩慢加入離心液上方，保證兩層液體之間界面清楚。3 800 r/min離心30 min，可見上清與離心液之間有一層HSCs形成的絮狀沉淀。小心吸取此層沉淀，裝入10 mL玻璃離心管，3 mL DMEM懸浮，2 500 r/min離心5 min，重復1次，所得HSCs沉淀用3 mL含20%胎牛血清的DMEM懸浮，供細胞培養用，同時取90 μL細胞懸液以鑒定細胞活性。

1.2.3 細胞培養 (1)原代培養:將分離所得3 mL HSCs細胞懸液接種于50 mL塑料培養瓶，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中。24 h后換液，以后每48 h換液1次。一般10天左右細胞長滿瓶底約80%面積時，即可開始傳代培養。(2)傳代培養:用1 mL 0.25%的胰酶加入培養瓶消化2 min。顯微鏡下觀察瓶壁細胞變圓后，棄去胰酶，加入2 mL含10%胎牛血清DMEM中止消化。吸管吹打，制成細胞懸液;移入10 mL玻璃離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清;沉淀用3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基懸浮，每毫升細胞懸液接種于1個50 mL塑料培養瓶。將此傳代后的HSC置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養。

1.2.4 HSCs活性鑒定 臺盼藍拒染實驗，光鏡下觀察剛分離出的HSCs，未著色者為活細胞。

1.2.5 HSCs性質鑒定 (1)形態學:光鏡觀察原代HSCs培養過程中的形態變化。(2)免疫細胞化學:采用 Desmin抗體鑒定，將原代培養10天的HSCs以1×105/mL濃度接種于24孔板，繼續培養24 h，冷丙酮固定，SABC法染色，DAB顯色，著色者為陽性。

2 結果

2.1 細胞得率及活率

本法分離的細胞得率為(2.35 ±0.15)×107/每肝，細胞活率為(95.5 ±0.6)%。

2.2 細胞性質鑒定

2.2.1 形態學 剛分離的HSCs呈圓形、橢圓形，含較多脂滴，透明度高。24 h后細胞貼伸出偽足。培養7天后細胞呈明顯的梭形、星形，細胞透明度降低(圖1～3)。

圖1 剛分離的HSCs(×200)

圖2 原代培養7天的HSCs(×200)

圖3 原代培養第10天的HSCs(×200)

2.2.2 免疫細胞化學 原代培養10天的HSCs用Desmin抗體鑒定，SABC法免疫細胞化學染色(圖4)。HSCs陽性率為(92.4 ±1.5)%。

圖4 原代培養10天的HSCs免疫細胞化學染色(SABC法，×200)

3 討論

HSCs在肝纖維化的過程中扮演重要角色［6］。HSCs的分離提取方法不斷改進，其中以原位灌注法最常使用，但其步驟繁瑣，不易操作。為簡化HSCs提取步驟，縮短實驗時間，我們在常規方法的基礎上做了一些改進:(1)HSC與Kuffer細胞密度有一定交叉，密度梯度離心液的精確配制是細胞成功提取的前提。Percoll作為一種密度梯度離心介質，粘滯度低，梯度容易形成，對細胞無毒性。本實驗參考了不同濃度的Percoll密度表，將Percoll與PBS混勻，用密度計調配密度到1.053，有效保證了密度梯度離心液的精度，也降低了配液難度。(2)選用硬膜外導管作為門靜脈的插管。硬膜外導管在硬度與韌性方面是理想的大鼠門靜脈插管材料，可有效提高插管成功率，有利于控制灌注速度。但是，肝臟中的肝細胞與HSCs粘附緊密，酶消化不足將降低細胞得率，消化過度則降低細胞活性。因此，對肝臟消化程度的把握與實驗者的經驗有一定關系。總之，本實驗方法分離提取HSCs無需特殊設備和昂貴試劑，在保證細胞得率、活率及純度的前提下簡化了操作步驟，簡單易行。

［1］Reeves HL，Friedman SL.Activation of hepatic stellate cells-a key issue in liver fibrosis［J］.Front Biosei，2002，1(7):d808-d826.

［2］Knook DL，Seffelaar AM，de Leeuw AM.Fat-storing cells of the rat liver:Their isolation and purification ［J］.Exp Cell Res，1982，139(2):468-471.

［3］Friedman SL，ROLL FJ.Isolation and culture of hepatic lipocytes，Kupffer cells，and sinus oidal endothelial cells by density gradient centrifugation with stractan［J］.Anal Biochem，1987，161(1):207-218.

［4］翁山耕，冷希圣，魏玉華，等.改良法大鼠肝星狀細胞培養與鑒定［J］.北京大學學報，2001，33(1):83-86.

［5］Riccalton-Banks L，Bhandari R，Fry J，et al.A simple method for the simultaneous isolation of stellate cells and hepatocytes from rat liver tissue［J］.Mol Cell Biochem，2003，248(1-2):97-102.

［6］Li D，Friedman SL.Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellate cells:new insights and prospects for therapy［J］.J Gastroenterol Hepatol，1999，14(7):618-633.