NGAL、MMP-9在食管癌中的表達(dá)及其臨床意義

劉文健， 王茂生

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)之一，其病因及發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，至今尚未明確。人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Lipocalin家族的成員之一，由Kjeldsen等在中性粒細(xì)胞的特殊顆粒中首先發(fā)現(xiàn)的25 kD的糖蛋白［1］。有研究表明NGAL能調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性，并可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展特別是腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等過程［2-3］。MMP-9屬于鋅肽酶超家族成員之一，能降解對腫瘤轉(zhuǎn)移起屏障作用基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［4］。有關(guān)MMP-9與食管癌浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系雖有部分文獻(xiàn)報道，但NGAL與食管癌浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，迄今國內(nèi)外均未見報道。本文旨在探討NGAL與MMP-9在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，并探討兩者的相關(guān)性，尋找食管癌早期診斷和判斷預(yù)后的新指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集茂名市人民醫(yī)院2006年1月至2010年12月食管癌手術(shù)切除標(biāo)本58例，其中男性34例，女性24例，年齡45～88歲，平均年齡(61.6±4.5)歲;病理證實(shí)均為食管癌，其中鱗癌48例、腺癌10例;高、中、低分化分別為13、24、21例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例。所有患者術(shù)前均未行放化療及其他治療史。另選取18例活檢正常食管組織。全部標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，以備免疫組化使用。

1.2 主要實(shí)驗試劑 SABC免疫組化試劑盒、兔抗NGAL多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、DAB顯色劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 免疫組化及 HE染色 采用 ABC法，兔抗NGAL多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體用PBS稀釋，稀釋倍數(shù)為1∶300，每個標(biāo)本蠟塊取4張切片，分別標(biāo)上A、B、C、D(A為檢測NGAL的表達(dá)，B為檢測MMP-9的表達(dá)，C為HE染色，D為陰性對照)脫蠟，抗原經(jīng)高溫高壓修復(fù)處理，抗原修復(fù)液為枸櫞酸鹽緩沖液，PBS沖洗，滴加一抗，4℃濕盒過夜，滴加生物素化通用型二抗，經(jīng)DAB染色，蘇木素復(fù)染后，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。嚴(yán)格按照說明書步驟操作。顯微鏡觀察，以胞漿有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。在400倍光鏡下選取表達(dá)區(qū)域攝像，用Image-Pro Plus 5.1圖像處理與分析系統(tǒng)對收集圖像進(jìn)行處理。

1.4 結(jié)果判斷 檢測均以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。鏡下觀察腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用Garvia的判定方法評判MMP-9和NGAL表達(dá)的強(qiáng)度:(1)細(xì)胞胞質(zhì)著色深淺，基本不著色為0，淺棕色為1，深棕色為2。(2)陽性著色細(xì)胞比例，＜20%為1，20% ～50%為2，＞50%為3。(3)以上2項相加，2為(+)，3～4為(++)，＞4為(+++)。(4)未著色細(xì)胞質(zhì)為(－)。(5)≥3為高表達(dá)，＜3為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩樣本率的比較及兩蛋白之間的相關(guān)性采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌與正常食管組織中NGAL與MMP-9的表達(dá) 由表1、圖1～9可見NGAL與MMP-9在食管癌中的表達(dá)明顯高于其在正常食管組織中的表達(dá)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 NGAL與MMP-9在食管癌中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 由表2可見NGAL與MMP-9在食管癌中的表達(dá)與患者的性別、年齡、組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05)，而與腫瘤的浸潤、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P ＜0.05)。

2.3 NGAL與MMP-9在食管癌中表達(dá)的相關(guān)性由表3可見NGAL和MMP-9兩者都是陰性的有8例，一為陰性一為陽性17例，兩者均為陽性33例;統(tǒng)計學(xué)分析顯示NGAL和MMP-9在食管癌中的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)性(r=0.572，P ＜0.05)。

表1 不同食管癌組織中NGAL、MMP-9表達(dá)情況

圖1～3 分別為正常食管組織、鱗癌、腺癌的HE染色

圖4～6 分別為NGAL在正常食管組織、鱗癌、腺癌中的表達(dá)

圖7～9 分別為MMP-9在正常食管組織、鱗癌、腺癌中的表達(dá)

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌，其發(fā)病率和死亡率各國差異很大，我國是食管癌高發(fā)地區(qū)之一。浸潤和轉(zhuǎn)移是食管癌晚期致死的主要原因之一。惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是以細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMP-9可特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，促進(jìn)新生血管的形成，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［4］。MMP-9在食管癌中呈現(xiàn)過表達(dá)并在浸潤轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色［5］。國內(nèi)劉威、王憲遠(yuǎn)等研究認(rèn)為，血漿MMP-9的水平與腫瘤的侵襲能力呈正相關(guān)［6-7］。有研究顯示NGAL基因可能是人類的一種新的癌基因，但其在腫瘤中的確切功能尚不清楚。NGAL與食管癌、甲狀腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和白血病等其他惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后有著密切關(guān)系［3-8］，是一種具有多功能的25 kD糖蛋白，可通過二硫鍵結(jié)合MMP-9 并調(diào)節(jié)其活性［9］。Kubben、Zhang 等［10-11］研究表明NGAL/MMP-9的水平及其基因表達(dá)均與腫瘤的浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正比關(guān)系。李恩明等［12］研究認(rèn)為，NGAL基因在腫瘤中的作用可能是調(diào)節(jié)保護(hù)MMP-9，并與之形成異源二聚體(NGAL/Pro-MMP-9)，并以此促進(jìn)惡變細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)NGAL、MMP-9在食管癌組織中的表達(dá)明顯增高，且二者的表達(dá)存在密切的相關(guān)性，在食管癌的發(fā)病過程中可能存在協(xié)同作用。食管癌組織中NGAL與MMP-9的表達(dá)強(qiáng)度與食管癌的分化程度、浸潤及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，二者高表達(dá)預(yù)示著腫瘤有較強(qiáng)的侵襲力和較差的預(yù)后，有望成為食管癌診斷的新的分子指標(biāo)并對食管癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著重要的參考意義。但兩者具體的協(xié)同機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

表2 NGAL、MMP-9表達(dá)與食管癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

表3 食管癌中NGAL與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性

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