siRNA下調(diào)TROP-2基因表達(dá)對人胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

瞿彩興， 馬 圭， 范 鈺

近年來，胰腺癌發(fā)病率明顯增高。腫瘤轉(zhuǎn)移是細(xì)胞遷移侵襲的結(jié)果，也是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多階段多步驟的過程，許多基因共同調(diào)控導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物改變，影響其生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)鈣信號傳導(dǎo)蛋白-2(tumor-associated calcium signal transducer-2，TROP-2)基因在人胰腺癌組織中高表達(dá)，且與癌細(xì)胞侵襲有關(guān)［1］。但是國內(nèi)相關(guān)的研究甚少，2011年3月—2011年5月，本課題組以胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞為模型，考察小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)對胰腺癌細(xì)胞中TROP-2表達(dá)、胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞株為本院組織細(xì)胞生物庫凍存。TROP-2基因siRNA購自德國Qiagen公司。RBMI 1640培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司;Trizol、RealTime PCR擴(kuò)增試劑盒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司;鼠抗人TROP-2及β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;基底膜基質(zhì)Matrigel購自美國Becton Dickinson公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。待對數(shù)生長期時，收取細(xì)胞，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染 借助于 LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作參照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1d，將1.0×105對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔，培養(yǎng)過夜，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組:(1)空白對照組(Con-A)為未經(jīng)任何處理的胰腺癌細(xì)胞;(2)空載對照組(Con-B)為脂質(zhì)體對照組;(3)siRNA組為10%FBS的RPMI 1640中含不同濃度的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。

1.4 胰腺癌細(xì)胞TROP-2 mRNA水平檢測 采用熒光實(shí)時定量RT-PCR方法檢測。收集細(xì)胞，以TRIzol抽提細(xì)胞總 RNA，取總 RNA 1 μg，以 oligo dT(15 mer)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2 μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。TROP-2上游引物序列為5'-TCCACTTGTATCATGGCCTACC-3'，下游引物序列為:5'-CTCAAAGACATCCAAACTGCGT-3'，擴(kuò)增片段長度111 bp。β-actin上游引物序列為:5'-CACG AAACTACCTTCAACTCC-3'，下游引物序列為:5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3';擴(kuò)增片段長度262 bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃，預(yù)變性3 min，95℃，30 s;52℃，45 s;72℃，45 s;35個循環(huán)后，72℃再延伸7 min。反應(yīng)后生成熔解曲線。TROP-2基因表達(dá)值以 2-ΔΔCt表示［2］。

1.5 TROP-2基因蛋白水平檢測 采用免疫熒光法檢測。將胰腺癌細(xì)胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞和蓋玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加TROP-2單克隆抗體(1∶1 000)覆蓋整個切片，4℃過夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的二抗，37℃保溫30 min。PBS振洗2次后用蒸餾水振洗。50%緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察，拍照，熒光強(qiáng)度掃描。

1.6 細(xì)胞遷移檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］方法，采用劃痕實(shí)驗(yàn)(wound-healing Assay)方法檢測。將細(xì)胞接種于6孔板，以含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞將近長滿，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以l mL移液器吸頭在細(xì)胞層仔細(xì)劃痕，以PBS洗兩遍，去除細(xì)胞碎片，更換含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h，倒置顯微鏡下對劃痕前后的相應(yīng)區(qū)域拍照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行孔，重復(fù)3次。倒置顯微鏡下測量細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的相對距離，根據(jù)原始細(xì)胞致傷區(qū)距離計算出細(xì)胞實(shí)際遷移距離。

1.7 細(xì)胞侵襲檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］方法，采用Boyden小室模型檢測癌細(xì)胞侵襲能力:Boyden小室上下室之間鋪聚碳酸醋微孔濾膜(孔徑8 μm)，濾膜上包被有Matrigel。用無血清培養(yǎng)基準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液，并調(diào)整濃度為2.5×104/mL。細(xì)胞以500 μL無血清培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)小室的上層，小室下層加入500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化物。在37℃，5%CO2，飽和濕度條件下分別培養(yǎng)72 h后，用棉拭子去除上室底部基質(zhì)膠并移除未侵襲細(xì)胞;接著固定 30 min，PBS漂洗 2次;HE染色30min。隨機(jī)選擇5個100倍顯微視野，統(tǒng)計視野中的總細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。每組設(shè)3個平行樣本，取其平均值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平的影響 定量PCR和免疫熒光結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TROP-2蛋白水平明顯下降，且呈濃度和時間依賴性(P＜0.001;P＜0.001)。見圖1，2。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染對胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞TROP-2基因mRNA水平的影響

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染對胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞TROP-2基因蛋白水平(×102)的影響

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染對胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞遷移的影響 劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，TROP-2 siRNA轉(zhuǎn)染組遷移距離明顯低于對照組(P＜0.001)。見圖3。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對CFPAC-1細(xì)胞侵襲能力的影響B(tài)oyden小室上室細(xì)胞穿過膜上matrigel到膜的下室面，其數(shù)量反映了細(xì)胞侵襲能力的大小。Boyden小室結(jié)果顯示，與對照組比較，TROP-2siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降，且呈濃度依賴性(P＜0.001)。見圖 4。

圖3 TROP-2基因siRNA轉(zhuǎn)染對胰腺癌細(xì)胞遷移的影響

圖4 TROP-2 siRNA轉(zhuǎn)染對胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

TROP-2亦稱為M1S1，是GA733基因家族中的一員，定位在1號染色體短臂D1S2890和D1S2801之間一個長約2.6 cm的區(qū)域上［4］。TROP-2是無內(nèi)含子的基因，所編碼的產(chǎn)物為含有323個氨基酸、35.7 kDa的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)抗原，其包含一個上皮生長因子樣的重復(fù)區(qū)，一個甲狀腺球蛋白樣重復(fù)區(qū)，其分子羥基端含有絲氨酸和酪氨酸位點(diǎn)及PIP-2結(jié)合區(qū)域，其絲氨酸殘端為激酶C所磷酸化。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TROP-2基因在許多實(shí)體瘤如大腸癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤中高表達(dá)［5-7］，且其高表達(dá)與侵襲有關(guān)［8-10］。由此提示，TROP-2基因是一種有價值的治療靶點(diǎn)，但該基因在國內(nèi)研究甚少。

本研究以胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞為模型，采用TROP-2基因siRNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞后，分別以熒光實(shí)時定量PCR和免疫熒光方法檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組胰腺癌細(xì)胞TROP-2 mRNA和蛋白明顯下調(diào)，且呈時間和濃度依賴性(P ＜0.001;P ＜0.001)。

癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。其中細(xì)胞遷移及侵襲是關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)通過siRNA下調(diào)胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞中TROP-2的表達(dá)，并觀察對癌細(xì)胞 遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，TROP-2基因表達(dá)下調(diào)后，癌細(xì)胞遷移和侵襲力均明顯下降，且呈濃度依賴性(P ＜0.001，P ＜0.001)。

目前尚不清楚TROP-2基因在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲中的分子機(jī)制，相關(guān)研究也較少，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TROP-2抗體對胞漿內(nèi)鈣離子水平具有一定的調(diào)控作用［11］，而蛋白激酶 C(protein kinase C)及鈣離子水平在信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，為明確TROP-2基因靶向治療作用，有必要深入研究TROP-2基因的具體分子機(jī)制，為今后胰腺癌的診治提供新思路。

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